Процес оцінки розвитку алкогольнозалежної гіпертензії в експерименті

Процес оцінки розвитку алкогольнозалежної гіпертензії в експерименті, який полягає у тому, що досліджують біологічні зразки, а саме гомогенати тканин легень, серця, нирок щурів, визначають та оцінюють контрольні показники, який відрізняється тим, що додатково досліджують сироватку крові, як контрольні показники визначають активність катепсину G та кальпаїнів в гомогенатах тканин легень, серця, нирок та в сироватці крові, при збільшенні активності катепсину G в 3-5 разів, активності кальпаїнів - в 14 разів і більше судять про розвиток патогенетичних змін, обумовлених тривалим впливом алкоголю з виключенням впливу тривалого емоційного стресу. Корисна модель на процес відноситься до біохімії, і може бути використана в експериментальній медицині для оцінки розвитку гіпертензії та супутнього ураження внутрішніх органів за умов гіпертензії під впливом алкоголю. Актуальність пошуку специфічних та інформативних критеріїв оцінки розвитку алкогольнозалежної гіпертензії обумовлено розповсюдженням артеріальної гіпертонії (АГ) у популяції, яке становить 26,1%, з віком - зростає недостовірне; у групі чоловіків, які не вживають алкоголь, вище (39,4%), ніж у тих хто вживає (24,6%), або вживав (30,6%). При частоті вживання алкоголю від кількох разів на тиждень до щоденного розповсюдження АГ становить 37,9%, при помірному вживанні - 23,4%, при рідкому - 21,7%. Відомий "Спосіб оцінки розвитку порушень функціонування внутрішніх органів при гіпертензії в експерименті" (Україна) (див. Деклар. патент України №62342А МПК G01 N33/00 Заявка №2003032054. Дата подачі заявки: 07.03.03р. Автори: Самохіна Л.М., Бондар Т.М., Зубов П.М., Ломако В.В. - Опубл.: 15.12.2003. - Бюл.№12.) - прототип, який полягає у тому, що досліджують біологічні зразки, а саме гомогенати тканин легень, серця та нирок щурів. Проводять оцінку у якості контрольних показників вмісту оксиду азоту та основ Шифа (ОШ) в нейтральних (НЛ) і фосфоліпідах (ФЛ) у щурів. За зміною вмісту контрольних показників свідчать про виникнення дисфункції нирок при гіпертензії внаслідок впливу токсичного або емоційного стресу; при підвищенні вмісту обох контрольних показників у серці свідчать про локальні патогенетичні зміни під впливом психоемоційного стресу, при підвищенні вмісту оксиду азоту та ОШ в НЛ у нирках свідчать про локальні патогенетичні зміни під сумісним впливом психоемоційного та токсичного стресу, при підвищенні лише вмісту ОШ в ФЛ легень свідчать про патогенетичні зміни у легенях під впливом токсичного стресу. Недоліком відомого рішення є низька специфічність контрольних показників із-за їх однакової чутливості до впливу як емоційного, так і токсичного стресу. В основу корисної моделі поставлена задача розробити такий процес оцінки розвитку алкогользалежної гіпертензії в експерименті, у якому вибір більш специфічних та інформативних біохімічних показників забезпечить здійснити оцінку розвитку порушень функціонування легень, серця, нирок при гіпертензії за умов тривалого впливу алкоголю на організм та виключити вплив тривалого емоційного стресу. Ця задача вирішується тим, що досліджують біологічні зразки, а саме гомогенати тканин легень, серця, нирок щурів, визначають та оцінюють активність контрольних показників. Відрізняючими ознаками корисної моделі на процес у порівнянні з прототипом є те, що: - додатково досліджують сироватку крові; - у якості контрольних показників визначають активність катепсину G та кальпаїнів в гомогенатах тканин легень, серця, нирок та в сироватці крові; - при збільшенні активності катепсину G в 3-5 СО 00 00 4883 разів, активності кальпаїнів - в 14 разів і більш судять про розвиток патогенетичних змін, обумовлених тривалим впливом алкоголю з виключенням впливу тривалого емоційного стресу. Додаткове введення в відомий спосіб дослідження сироватки крові сприяє підвищенню достовірності оцінки змін, що виникають в організмі за умов того чи іншого впливу стресу, що обумовлено неспецифічним характером розвитку стресової реакції організму на фоні найбільшого ураження легень, серця та нирок за умов стимульованої гіпертензії. Крім того, денатуровані, модифіковані в результаті впливу стресових факторів білки надходять у кров і активують нейтрофіли (Berlett B.S., Stadtman E.R.//J. of Biol. Chem. - 1997. - V.272, N33. - Р.20313-20316). В результаті генеруються активні метаболіти кисню, що приводить до дегрануляції гранул нейтрофілів і виходу протеолітичних ферментів у кров (Белова Л.А., Биохимия. 1997. - Т.62, №6. - С.659-668). Це доказує необхідність визначення контрольних показників не тільки в гомогенатах тканин, але й в сироватці крові. Вибір в якості критеріїв активності катепсину G та кальпаїнів та їх визначення одночасно в гомогенатах тканин легень, серця, нирок та в сироватці крові дозволяє підвищити специфічність та інформативність оцінки розвитку алкоголь-залежної гіпертензії та супутніх патологічних змін внутрішніх органів. Крім цього забезпечується можливість виключити вплив тривалого емоційного стресу. Це обумовлено тим, що з хронічною алкогольною інтоксикацією пов'язано ряд порушень обміну білків та амінокислот, розвивається дефіцит білку та інш. (Смирнов В.Ю., Разводовский Ю.Е., Дорошенко Е.М., Островский С Ю . // Укр.біох.журн. 2003. - Т.75, №4. - С.101-107). Катепсин G в результаті взаємодії з ендотелієм судин, призводить до затримки натрію в судинній стінці, що викликає її набряк і сприяє розвитку артеріальної гіпертонії (Белова Л.А., Оглоблина О.Г., Чихладзе Н.М.//С6. фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. - 1998. Т.1.- С. 176-179). У результаті деструктивної дії протеолітичних ферментів, у тому числі катепсину G, судинна стінка втрачає свою еластичність, стає ригідною до сили тиску току крові. Зростання активності катепсину G призводить до збільшення утворення вазоконстрикторного пептиду ангіотензину II з ангіотензину І та ангіотензиногену. Кальпаїни беруть участь в передачі сигналів, розщепленні білків цитоскелету, розвитку запальних процесів та пошкоджень, обумовлених активними метаболітами кисню та інш. За умов гіпертензії відзначають хронічний оксидативний стрес (Ельчанинова С.А., Галактионова Л.П., Толмачева Н.В., Варшавский Б.Я. // Тер. Архив. - 2000. - 72, №4. - С.51-53; Touyz R.M., Schiffrin E.L. // J. Hypertens. - 2001 - 19, №7. P.1245-1254), який супроводжується підвищенням надходження Са 2 + в клітину і активацією кальпаїнів (Ray S.K., Fidan M., Nawak M.W. //Brain Res. - 2000. - Vol.852, №2. - P.326-334; Ray S. K., Wilford G.G., All S.F., Banik N.L. //Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2000. Vol.914. - P.275-283; Ishihara I., Minami Y., Nishizaki Т., Matsuoka Т., Yamamura H. // Neurosci. Lett. 2000. - Vol.279, №2. - P.97-100), які в свою чергу можуть поглиблювати розвиток цього процесу. Взагалі, активація кальпаїнів веде до лімітованого протеолізу деяких ключових білків, включаючи інтегрин ІІЬЗ, структурні білки цитоскелету талін та актин- зв'язуючий білок, сигнальні білки ppl25FAK, pp60c-src, PTP-1B, протеїнкіназу С, фосфоліпазу С (Schoenwaelder S. et al. // J. Biol. Chem. 1977. - Vol.272. - P.24876-24884). Розщеплення зв'язаних з цитоскелетом структурних білків і сигнальних ферментів веде до зменшення контакту цитоскелету та інтегрину ІІЬЗ і зменшення ретракції фібринового згустку. Ці протеолітичні процеси призводять до дисоціації актину цитоскелету від ділянок його контакту з мембраною і звільнення багатих прокоагулянтами пухирців з клітинної поверхні. Це може сприяти тромбозу судин, розвитку атеросклерозу та ішемії (Малая Л.Т., Корж А.Н., Балковая Л.Б. Эндотелиальная дисфункция при патологии сердечно-сосудистой системы. /Изд-во «Торсинг», Харьков. - 2000). Порушення ендотелій-залежних реакцій в атеросклеротичних коронарних артеріях у свою чергу може сприяти збільшенню вазоконстрикції. Експериментальні дослідження, що проведено в лабораторії імуноферментних методів досліджень Інституту терапії імені Л.Т.Малої АМН України показали, що саме при збільшенні активності катепсину G в гомогенатах тканин легень, серця, нирок щурів та в сироватці крові в 3-5 разів, активності кальпаїнів - в 14 разів і більш дає можливість оцінити розвиток порушень функціонування легень, серця, нирок при гіпертензії за умов тривалого впливу алкоголю на організм та виключити вплив тривалого емоційного стресу. Використання запропонованого процесу оцінки дозволяє підвищити специфічність та інформативність дослідження. Відтвореність заявляемого процесу становить не менш 95%. Запропонований процес здійснюють у такій послідовності: 1. Групі щурів (п=6), які з першого дня проявляють схильність до 5% розчину етилового спирту, провокують хронічний алкоголізм шляхом прийому протягом 10 місяців 15% етанолу щодня без обмежень до появи у щурів стійкої гіпертензії, яку контролюють по стабільно підвищеному артеріальному тиску (AT). Тиск контролюють за допомогою медичного тонометра, для цього манжету накладають на хвіст. Контрольна група - інтактні тварини відповідного віку (п=6). 2. Проводять декапітацію тварин. За запропонованим процесом додатково проводять біохімічне дослідження сироватки крові. Для цього кров збирають у пробірки, сироватку видаляють центрифугуванням і при необхідності зберігають при -20°С до аналізу. 3. Тканини органів легень, серця, нирок (100мг/мл) гомогенізують в фізіологічному розчині на холоді. Отримані гомогенати центрифугують 10хв. при 5000д на центрифузі РС-6 при 4°С. При необхідності зберігають при -20°С до аналізу. 4883 4. Для оцінки розвитку алкоголь-залежної гіпертензії досліджують біологічні зразки, а саме сироватку крові та гомогенати тканин легень, серця, нирок експериментальних тварин. Визначають активність вибраних у якості контрольних показників катепсину G та кальпаїнів відомими наборами, наприклад: - Деклар. Патент України №44066А; МПК G01 N33/48; Набір для визначення активності або концентрації катепсину G в біологічних рідинах. /Самохіна Л.М., Кравченко Н.О., Максимова Н.А.; Заявка №2001042261, дата подачі: 05.04.01р.; Опубл. 15.01.02р. - Бюл.№1. - Деклар. Патент України №46357А; МПК G01 N33/48, А61В19/02; Набір для визначення активності кальпаїнів в біологічних рідинах. / Самохіна Л.М., Самохін А.А.; Заявка №2001074537, дата подачі: 02.07.01р.; Опубл. 15.05.02р. - Бюл.№5. 5. При збільшенні активності катепсину G в 3-5 разів, активності кальпаїнів - в 14 разів і більш судять про розвиток патогенетичних змін, обумовлених тривалим впливом алкоголю з виключенням впливу тривалого емоційного стресу. Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується прикладом. Приклад. Процес оцінки розвитку алкогользалежної гіпертензії в експерименті у щурів в порівнянні з дією тривалого емоційного стресу. 1. Групі тварин (п=6), які з першого дня проявляють схильність до 5% розчину етилового спирту, провокують хронічний алкоголізм шляхом прийому протягом 10 місяців 15% етанолу щодня без обмежень до появи у щурів стійкої гіпертензії, яку контролюють по стабільно підвищеному артеріальному тиску (AT). Тварин містять у клітці в умовах вільного вибору між водою і розчином етанолу. Використовують «двохскляночний метод». Протягом першого тижня щури одержують 5% розчин етанолу, протягом другого - 10%, а третій тиждень і до кінця експерименту (забою) -15%. Спочатку, тобто в період формування потягу до алкоголю, щури споживають 5-15мл/кг, потім до 50мл/кг. Загальний термін споювання становить 11 місяців. У окремої групи тварин (п=6) викликають емоційний стрес шляхом болючих електричних подразнень переривчасте (15с - вплив, 45с - перерва) протягом 30хв. Для цього використовують освітлену камеру, до підлоги якої підведений електричний струм, замикання контактів для його подачі роблять за допомогою маніпулятора. Поріг чутливості визначають для кожної тварини індивідуально, напруга не перевищує 50В. Періодичність впливу один сеанс раз на добу протягом 3-х місяців. Тиск контролюють за допомогою медичного тонометра, для цього манжету накладають на хвіст. Контрольна група - інтактні тварини відповідного віку (п=6). 2. Проводять декапітацію тварин. За запропонованим процесом додатково проводять біохімічне дослідження сироватки крові. Для цього кров збирають у центрифужні пробірки, сироватку видаляють і при необхідності зберігають при -20°С до аналізу. 3. Черевину тварини розтинають, печінку перфузують холодним середовищем виділення (0,25М сахароза, що була приготовлена на 0.025М трис-НСІ, рН7,5), видаляють та гомогенізують в гомогенізаторі Потера на льоду з розрахунку 0,5г тканини на 5мл середовища виділення. Легені, нирки та серце промивають холодним середовищем виділення, розтинають ножицями на дрібні шматочки, пропускають крізь прес, потім гомогенізують. Отримані гомогенати центрифугують Юхв при 5000д на центрифузі РС-6 при 4°С. Зберігають при -20°С до аналізу. 4. Для оцінки розвитку алкоголь-залежної гіпертензії та дії тривалого емоційного стресу досліджують біологічні зразки, а саме сироватку крові та гомогенати тканин легень, серця, нирок, приготовлені згідно п.З. Визначають активність вибраних у якості контрольних показників катепсину G та кальпаїнів відомими методами (див. с.4, п.4). Таблиця Результати дослідження: Показник Біологічний зразок Сироватка крові Легені Серце Нирки Активність катепсину G, мг/л г Тривалий Тривалий Контроль вплив вплив емоційалкоголю ного стресу 0,4 0,077 0,440 0,241 0,767 6,12 0,171 0,872 0,744 0,154 0,457 25,96 Аналізують результати дослідження (наведені в таблиці): Активність катепсину G за умов тривалого впливу алкоголю - в сироватці крові - в 5 разів вище, порівняно з контролем; - в легенях - в 3 рази вище, порівняно з контролем; - в серці - в 4 рази вище, порівняно з контро Активність кальпаїнів, мг/л г Тривалий Тривалий вплив емоційКонтроль вплив ного стресу алкоголю 17,81 0,716 1,6 0,315 0,448 6,686 1,312 0,763 11,939 0,544 9,977 1,19 лем; - в нирках - в 3 рази вище, порівняно з контролем; Активність катепсину G за умов тривалого впливу емоційного стресу - в сироватці крові - в 5 разів вище, порівняно з контролем; - в легенях - в 25 разів вище, порівняно з контролем; 4883 - в серці - в 5 разів вище, порівняно з контролем; - в нирках - в 168 разів вище, порівняно з контролем; Активність кальпаїнів за умов тривалого впливу алкоголю - в сироватці крові - в 24 рази вище, порівняно з контролем; - в легенях - в 16 разів вище, порівняно з контролем; - в серці - в 14 разів вище, порівняно з контролем; - в нирках - в 18 разів вище, порівняно з контролем; Активність кальпаїнів за умов тривалого впливу емоційного стресу - в сироватці крові - в 2 рази вище, порівняно з контролем; - в легенях - не вище, порівняно з контролем; - в серці - десь у 2 рази вище, порівняно з контролем; - в нирках - у 2 рази вище, порівняно з контролем. 5. Судять про розвиток патогенетичних змін, Комп'ютерна верстка В. Мацело 8 обумовлених тривалим впливом алкоголю, з виключенням впливу тривалого емоційного стресу, за збільшенням активності контрольних показників, а саме: катепсину G в 3-5 разів, кальпаїнів - в 14 разів і більш. Висновок: Таким чином, визначення і значне підвищення активності кальпаїнів і обмеження зростання активності катепсину G лише в 3-5 разів в гомогенатах тканин серця, легень, нирок та додатково в сироватці крові дозволяє встановити розвиток гіпертензії та супутнього ураження внутрішніх органів щурів в умовах стимульованого хронічного алкоголізму, при цьому є можливість виключити вплив тривалого емоційного стресу. Технічний результат Використання запропонованого процесу оцінки в експериментальній медицині в порівнянні з прототипом дозволяє підвищити специфічність і достовірність оцінки розвитку гіпертензії та патологічних змін внутрішніх органів під впливом алкоголю з виключенням впливу тривалого емоційного стресу. Відтвореність процесу оцінки становить не менш 95%. Підписне Тираж 37 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601