Спосіб очищення манозоспецифічних лектинів

Спосіб очищення манозоспецифічних лектинів, що включає проведення афінної хроматогра 3 13770 4 порушень їх структури. Для підвищення ефективосад видаляють, надосадову рідину доводять до ності десорбції її проводять при температурі рН8-9,2 з наступним видаленням осаду. Далі рН +40°С, яку лектини витримують без пошкоджень повертають до 6,0-7,0 і наносять на колонку афінструктури. ного сорбента, як і в прикладі 1. Об'єм сорбенту Одержання афінного сорбенту. 100см3 на кожні 1кг свіжої надземної частини рос3г дріжджового манану, одержаного за спосолини. Швидкість протікання екстракту - 1-2л за бом, описаним раніше [3], розчиняють в 100мл годину. Колонку промивають 0,1М ацетатним буводи з підігріванням. Далі до підігрітого розчину фером рН6,0-7,0 до зниження екстинції при 280нм додають 30г частково гідролізованого крохмалю, в рідині, що витікає, до значень менше 0,1. Зніодержаного за способом, описаним раніше [4], мання сорбованого на колонцілектину здійснюють суміш розмішують до гомогенної маси. Тоді дода0,1М калій-боратним буферним розчином рН8,2 ють 40мл 20% NaOH і 12мл епіхлоргідрину. Знову при температурі +40°С. Контроль виходу лектину з все старанно перемішують. Гель застигає за 15хв. колонки здійснюють на спектрофотометрі при Через 1 годину після вистигання гелю його пере280нм або за аглютинацією еритроцитів кролика. тирають через сито 0,5мм з додаванням води. Одержані фракції, що містять лектин, об'єднують, Загальний об'єм гелю - 500-600мл. Його декілька його висолюють сульфатом амонію (600г/л). Осад разів декантують і використовують в якості афінноцентрифугують, розчиняють в невеликій кількості го сорбенту. Сорбент може бути використаний для води і діалізують проти 0,05М фосфатного буферу очистки манозоспецифічних лектинів з цибулин рН7,0 і наносять на колонку ДЕАЕ-тойоперлу, вріабо надземної частини амарилісових та лілійних, вноважену тим же буфером, і промивають буфезокрема підсніжника (Galanthus nivalis L.), білоцвіту ром. Лектин з колонки іонообмінника знімають весняного (Leucoum vernum L), видів нарцису 0,2М фосфатним буферним розчином рН7,0. Фра(Narcissus sp.), крокуса весняного (Crocus vernus), кції, що містять лектин, об'єднують, висолюють кореневища купини багатоквіткової (Polygonatum сульфатом амонію і після діалізу проти дистильоmultiflorum /L./All), тощо. ваної води ліофільно висушують. Вихід лектину Приклади очистки лектинів. становить 200мг/кг трави білоцвіту весняного, зібПриклад 1 раного на початку цвітіння і 50-70мг/кг трави біло2,0кг надземної частини підсніжника цвіту весняного, зібраного в фенофазу плодоно(Galanthus nivalis L.), зібраної в фенофазі цвітіння, шення. гомогенізують в міксері з 5л 1% NaCI, що містить Приклад 3 50г тіосечовини. Екстракт підкислюють до рН5,0, 200г цибулин Crocus vernus, зібраних в феноосад видаляють, надосадову рідину доводять до фазу відносного спокою, гомогенізують в міксері з рН8-9,2, з наступним видаленням осаду. Далі рН 1л 1% NaCI, що містить 10г тіосечовини. Екстракт повертають до 6,5 і наносять на колонку афінного підкислюють до рН4,5-5,0, осад видаляють, надосорбенту, одержаного шляхом співполімеризації садову рідину доводять до рН8-9,2, з наступним частково гідролізованого крохмалю та дріжджововидаленням осаду. Далі рН повертають до 6,0-7,0 і го манану. Об'єм сорбента -100см3 на 1кг свіжої наносять на колонку афінного сорбента, що виконадземної частини рослини. Швидкість протікання ристано і в прикладі 1. Об'єм сорбенту - 100см3. екстракту - 1-2л за годину. Колонку промивають Швидкість протікання екстракту - 1л за годину. 0,1М ацетатним буфером рН6,0-7,0 до зниження Колонку промивають 0,1М ацетатним буфером екстинції при 280нм в рідині, що витікає, до знарН6,0-7,0 до зниження екстинції при 280нм в рідичень менше 0,1. Знімання сорбованого на колонці ні, що витікає, до значень менше 0,1. Зняття сорлектину здійснють 0,1М калій-боратним буферним бованого на колонці лектину здійснюється 0,1М розчином рН8,2 при температурі +40°С. Контроль калій-боратним буферним розчином рН8,2 при виходу лектину з колонки здійснюють на спектротемпературі +40°С. Контроль виходу лектину з фотометрі при 280нм або за аглютинацією еритколонки здійснюють на спектрофотометрі при роцитів кролика. Одержані фракції, що містять 280нм або за аглютинацією еритроцитів кролика. лектин, об'єднують, його висолюють сульфатом Одержані фракції, що містять лектин, об'єднують, амонію (600г/л). Осад центрифугують, розчиняють його висолюють сульфатом амонію (600г/л). Осад в невеликій кількості води і діалізують проти 0,05М центрифугують, розчиняють в невеликій кількості фосфатного буферу рН7,0 і наносять на колонку води і діалізують проти 0,05М фосфатного буферу ДЕАЕ-тойоперлу, врівноважену тим же буфером, і рН7,0 і наносять на колонку ДЕАЕ-тойоперлу, вріпромивають буфером. Лектин з колонки іонообвноважену тим же буфером, і промивають буфемінника знімають 0,2М фосфатним буферним розром. Лектин з колонки іонообмінника знімають чином рН7,0. 0,2М фосфатним буферним розчином рН7,0. ФраФракції, що містять лектин, об'єднують, високції, що містять лектин, об'єднують, висолюють люють сульфатом амонію і після діалізу проти дисульфатом амонію і після діалізу проти дистильостильованої води ліофільно висушують. Вихід лекваної води ліофільно висушують. Вихід лектину тину становить 200мг/кг трави підсніжника, 80-100мг на 100г сирих цибулин. зібраного на початку цвітіння, і 50мг/кг трави підсЧистоту одержаних препаратів оцінювали меніжника, зібраного в фенофазу плодоношення. тодом електрофорезу в градієнті 5-15% ПААГ в Приклад 2 присутності 0,1% ДДС - натрію з додаванням або 2,0кг надземної частини білоцвіту весняного без бета-меркаптоетанолу. Результати електро(Leucoum vernum L), зібраної в фенофазі цвітіння, форезу представлені на ілюстративному матеріагомогенізують в міксері з 5л 1% NaCI, що містить лі, де цифрами зліва позначено значення мол. 50г тіосечовини. Екстракт підкислюють до рН5,0 маси в кДа, а цифрами знизу позначено положен 5 13770 6 ня відповідних білків-маркерів та зразків лектинів exclusive specificity towards mannose from snowdrop підданих аналізу, а саме: (Galanthus nivalis) bulbs. //FEBS Lett, 1987. -V.215, 1-яєчний лізоцим (Мr=14,3), 2 - лектин сочевиNo1, p.140-144. ці (Мr=5,7+17,5), 3 - еритроаглютинін насіння ква2. Антонюк Л.Я. Очистка и некоторые свойства солі (Мr=32), 4 - лектин виноградного слимака лектинов из подснежника белоснежного (Galanthus (Мr=13 і 26), 5 і 6 - лектин підсніжника без та в nivalis L.) и белоцветника весеннего (Leucojum присутності меркаптоетанолу, 7 і 8 - те ж для лекvernum L.). //Биохимия -1993 -Т.58, №3.- С.367тину білоцвіту, 9 і 10 - те ж для лектину крокусу, 11 375. і 12 - те ж для лектину нарцису. 3. Биохимические методы анализа растений Аналіз одержаних препаратів вказує на гомо/под ред. Запромѐтова М.М.- Москва: Из-во ИЛ. генність та високу чистоту манозоспецифічних 1960, с.228-230. лектинів при застосуванні запропонованого спосо4. Антонюк В.О. Синтез сорбенту на основі побу. перечно-зшитого крохмалю для афінного очищенДжерела інформації: ня глюкозо (маннозо)специфічних лектинів. //Укр. 1. Van Damme Е., AlIen А.К., Peumans W. біохім. журн. -1991. -Т.63, №6. -С.97-100. Isolation and characterization of a lectin with Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601