Спосіб експрес-діагностики гнійних бактеріальних менінгітів

Спосіб експрес-діагностики гнійних бактеріальних менінгітів, що включає визначення наявності бактеріальних ендотоксинів у цереброспінальній рідині хворого, що включає проведення тестреакції у буферному середовищі екзогенного суб 3 16062 4 Бактеріальний менінгіт діагностують при темному Заявлений спосіб передбачає використання у забарвленні суміші. Тест чутливий до грампозититест-реакції гемолімфи личинок капустяної білянвних та грамнегативних бактерій. ки, яка є звичайним сільськогосподарським шкідПроте, зважаючи на стрімкий розвиток гнійних ником і може бути розведена в Україні як у приробактеріальних менінгітів, бажано скоротити час дних, так і у лабораторних умовах при цілорічній проведення тест-реакцій. Крім того, відомий спосіб наявності корму (капусти). передбачає використання плазми личинок тутовоЗа заявленим способом використовують розго шовкопряду, що харчуються виключно листям ведення ЦСР хворого фізіологічним розчином у шовковиці, ареал розповсюдження якої обмежеспіввідношенні 1:100, усуваючи тим самим можлиний певними кліматичними зонами. Наприклад, вий вплив інгібіторів ферментативної реакції і мішовковиця не є представником природної флори німізуючи кількість ЦСР, необхідної для діагносУкраїни, а існує лише у вигляді обмежених штучтики. них насаджень і не може бути джерелом зеленого Авторами проведені експериментальні дослікорму цілорічне при вирощуванні тутового шовкодження з використання заявленого способу для пряду у лабораторних умовах. Використання у діагностики гнійних бактеріальних менінгітів, вивідомому способі плазми личинок потребує провекликаних основними збудниками: Neisseria дення додаткової операції виділення плазми з геmeningitidis, Streptococcus pneumoniae, молімфи шляхом відокремлення гемоцитів. Haemophilus influenzae. Спосіб чутливий відносно Завданням корисної моделі є удосконалення всіх зазначених видів бактерій і на відміну від споспособу експрес-діагностики гнійних бактеріальних собу-прототипу дозволяє діагностувати менінгокоменінгітів шляхом використання гемолімфи капусковий менінгіт. тяної білянки при проведенні колориметричних Заявлений спосіб здійснюють наступним читест-реакцій за заявленими параметрами, що доном. У хворих з підозрою на гнійний бактеріальний зволяє вдвічі скоротити час діагностики, забезпеменінгіт забирають зразки ЦСР, які розводять фічує чутливість способу до грампозитивних та гразіологічним розчином у співвідношенні 1:100. До мнегативних бактерій, зокрема до специфічних одержаного розчину ЦСР додають буферний розменінгококів, які найскладніше виявити. чин екзогенного субстрату 3,4Поставлене завдання вирішується таким чидигідроксифенілаланіну та гемолімфу личинок ном, що у способі експрес-діагностики бактеріалькапустяної білянки, яку відбирають у стерильних них менінгітів шляхом визначення наявності бакумовах мікропіпеткою з пластиковим наконечнитеріальних ендотоксинів у ЦСР хворого, що ком. Завчасно відібрану гемолімфу до проведення включає проведення тест-реакції у буферному експерименту зберігають під шаром мінеральної середовищі екзогенного субстрату 3,4олії при 20°С. Одержану суміш інкубують при темдигідроксифенілаланіну з додаванням розведеної пературі 30°С протягом 60 хвилин. При наявності ЦСР хворого та компонентів крові личинок комах, темного кольору суміші після інкубації діагноступроведення інкубації одержаної суміші при темпеють гнійний бактеріальний менінгіт. ратурі 30°С та діагностування гнійного бактеріальДля визначення концентрації бактеріальних ного менінгіту за наявністю темного забарвлення ендотоксинів у ЦСР хворого за ступенем забарвсуміші, згідно з винаходом додатково передбачелення реакційної суміші використовують завчасно но, що використовують гемолімфу личинок капуспобудовану калібрувальну криву. Для цього протяної білянки (Pieris brassicae), ЦСР хворого розводять серію тест-реакцій за заявленим способом, водять фізіологічним розчином у співвідношенні додаючи до реакційної суміші замість розчину ЦСР 1:100, інкубацію суміші проводять протягом 60 хворого відомі дрібні зростаючі порції промислове хвилин, а кількісний вміст бактеріальних ендотокодержаного пептидоглікану і вимірюють будь-яким синів у ЦСР хворого визначають за ступенем завідомим способом оптичну щільність забарвленої барвлення суміші. суміші. Таким чином одержують калібровочну криТест-реакція, наведена у заявленому способі, ву, яка є функцією оптичної щільності суміші від обумовлена наступними причинами. У ЦСР хвороконцентрації пептидогліканів. го на гнійний бактеріальний менінгіт присутні пепКорисна модель ілюструється прикладами. тидоглікани, які є компонентами клітинних стінок Приклад 1 грампозитивних і грамнегативних бактерій. ГемоБуло проведено діагностування трьох груп палімфа личинок капустяної білянки містить природцієнтів по 10 чоловік за допомогою заявленого ний фермент профенол-оксидазу, яка виступає способу. У першу групу були відібрані хворі з менікаталізатором реакції взаємодії пептидогліканів з нгококовим менінгітом, підтвердженим попередніекзогенним субстратом 3,4ми бактеріологічними та молекулярнодигідроксифенілаланіном з утворенням меланіну, генетичними (ПЛР) дослідженнями. До другої груякий при проведенні інкубації забарвлює реакційну пи увійшли хворі з вірусним серозним менінгітом, суміш у темний колір. Активність ферменту, а отже підтвердженим серологічне. До обох цих груп були і ступінь забарвлення, пропорційна концентрації відібрані хворі у віці від 18 до 43 років з тяжким і бактеріальних ендотоксинів у ЦСР хворого. Реаксередньотяжким перебігом хвороби. Третю контція специфічна для грампозитивних і грамнегативрольну групу склали здорові особи з інтактною них бактерій. Забарвлення суміші не відбувається ЦСР. при наявності в ЦСР хворого вірусних збудників, У осіб всіх трьох груп відбирали зразки ЦСР у тим самим дозволяючи відрізнити гнійні бактеріаоб'ємі 0,5мл при надходженні у стаціонар у межах льні менінгіти від вірусних і оперативно призначизвичайної діагностичної спинномозкової пункції з ти необхідну етіотропну терапію. використанням одноразових пункційних голок і 5 16062 6 стерильних апірогенних одноразових пробірок для лися даними оптичної щільності реакційних суміпопередження хибно-позитивних результатів. Зрашей у різних варіантах дослідів, наведених у прикзки ЦСР розводили 0,9% розчином NaCI у співвідладі 1. За даними табл. 1 оптична щільність реакношенні 1:100. ційної суміші для кожного з 10-ти хворих на До 100мкл кожного зразку розведеної ЦСР доменінгококовий менінгіт варіює від 0,327нм до давали 100мкл Good's буферу з 10мкл екзогенного 1,818нм у залежності від концентрації ендотоксисубстрату 3,4-дигідроксифенілаланін (10мкг/мл) та нів у ЦСР. 10мкл гемолімфи личинок капустяної білянки, відіКонцентрацію бактеріальних ендотоксинів (пебраної у стерильних умовах. Одержану суміш інптидогліканів) у ЦСР хворих визначали за калібрукубували при 30°С протягом 60 хвилин. вальною кривою, попередньо одержаною при проДодатково проводили два контрольних досліведенні серії дослідів за заявленим способом при ди, коли замість розведеної ЦСР до реакційної використанні замість ЦСР хворих готового пептисуміші додавали 0,9% розчин NaCI без вмісту пепдоглікану (Іммафарма, Росія) у концентраціях від 0 ти-доглікану (негативний контроль) та розчин готодо 50пг/мл з встановленням однозначної відповідвого пептидоглікану -10пг/мл (позитивний контності між кожним конкретним значенням концентроль). рації пептидоглікану і значенням оптичної щільноТемне забарвлення сумішей спостерігалося у сті суміші, що містить цю кількість пептидоглікану. варіантах діагностування хворих на гнійних бактеКількісний вміст бактеріальних ендотоксинів ріальний менінгіт (менінгококовий менінгіт) та у (пептидогліканів) визначений за калібрувальною позитивному контролі. У варіантах з хворими на кривою для значень оптичної щільності, одержану вірусний менінгіт, здоровими пацієнтами та негау прикладі 1, наведені у таблиці 2. тивним контролем вірогідного забарвлення суміТаблиця 2 шей не відбулося. Оптичну щільність всіх одержаних сумішей піКонцентрація бактеріальних ендотоксинів (пептидогліканів) у сля інкубації вимірювали при довжині хвилі 490нм. ЦСР хворих у відповідності з оптичною щільністю реакційних сумішей, одержаних за заявленим способом Дані дослідів наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Оптична щільність варіантів сумішей, одержаних у відповідності з заявленим способом Кількість дослідів у кожному варіанті 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Оптична щільність сумішей за варіантами (нм) Хворі на Хвор Негатив- Позитивменінго- на вірус- Контрольний конт- ний конткоковий ний на група роль роль менінгіт менінгіт 0,840 0,097 0,121 0,058 1,987 0,648 0,130 0,097 0,048 1,748 0,421 0,143 0,056 0,057 1,697 0,327 0,087 0,047 0,087 1,748 0,987 0,056 0,068 0,087 1,748 1,200 0,087 0,113 0,087 1,748 0,641 0,087 0,089 0,087 1,748 0,345 0,087 0,074 0,087 1,748 0,445 0,087 0,087 0,087 1,748 1,818 0,087 0,087 0,087 1,748 Аналіз даних таблиця 1 свідчить, що при діагностуванні гнійного бактеріального менінгіту (у досліді - менінгококовий менінгіт) за заявленим способом оптична щільність одержаних реакційних сумішей вірогідно вище, ніж у варіантах з вірусним менінгітом, контрольною групою та негативним контролем, і ближче до даних позитивного контролю. Таким чином, заявлений спосіб дозволяє проводити достовірну діагностику гнійних бактеріальних менінгітів, відокремлюючи їх від вірусних менінгітів. Приклад 2 Для кількісного визначення концентрації бактеріальних ендотоксинів у ЦСР хворих скористаКомп’ютерна верстка Н. Лисенко Кількість дослідів у кожному варіанті 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Концентрація пептидогліканів, пг/мл Хворі на менінгокоХворі на Контрольна ковий менінгіт вірусний група пацієнменінгіт тів 22,6 0,8 1,5 17,1 1,8 0,8 10,3 2,2 0,0 7,7 0,5 0,0 26,9 0,0 0,1 32,9 0,7 1,1 16,8 0,8 0,5 8,3 0.5 0,1 11,1 0,2 0,5 50,4 0,0 0,1 Дані таблиці 2 підтверджують наявність пропорційної залежності між оптичною щільністю реакційної суміші (ступенем забарвлення) і концентрацією бактеріальних ендотоксинів у ЦСР хворого. Дані таблиці 2, одержані при діагностуванні хворих на менінгококовий менінгіт за заявленим способом, достовірно вищі за дані для хворих на вірусний менінгіт та контрольної групи пацієнтів. Таким чином, заявлено новий спосіб експресдіагностики гнійних бактеріальних менінгітів, який дозволяє достовірно відрізнити бактеріальні менінгіти від вірусних і вдвічі скоротити час тест-реакції у порівнянні з прототипом. Заявлений спосіб передбачає використання без додаткової обробки гемолімфи личинок капустяної білянки, яку легко вирощувати у кліматичних умовах України, крім того спосіб дозволяє мінімізувати необхідну для діагностики кількість ЦСР хворого. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601