Спосіб культивування клітин кордової крові

Спосіб культивування клітин кордової крові, що включає вилучення популяції стовбурових клі 3 рових клітин, обумовлений їх примітивністю. В результаті чого кількість колоній не є високою, тобто їх проліферативний потенціал не розкривається. Причиною цього, на наш погляд, є умови культивування, які хоча забезпечують підтримку клітинпопередників, але не сприяють значному збільшенню їх кількості. В основу корисної моделі поставлена задача підвищення ефективності способу культивування стовбурових клітин за рахунок створення оптимальних умов для їх активної проліферації і диференціації. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що у способі культивування АС133+ клітин кордової крові, який включає вилучення популяції стовбурових клітин та їх найближчих нащадків (а саме, АС133+ клітин) з кордової крові шляхом очищення мононуклеарної фракції кордової крові за допомогою AC133 антитіл-кон'югованих супермагнетичних мікронамистинок і Мінімакс-колонки, їх культивування in vitro з комплексом ростових факторів (цитокінів), наступне культивування у напіврідкому агарі і визначення кількості колоній, додатково проводять інкубацію очищеної популяції клітин кордової крові з ростовим фактором Flt-3 (Lot 073K1435). Інкубацію проводять перед культивуванням in vitro у живильному середовищі протягом 12-18 годин. Між сукупністю суттєвих ознак способу, що заявляється, і технічним результатом, що досягається, мається наступний причинно-наслідковий зв'язок. Найближчі нащадки стовбурових гемопоетичних клітин, такі як АС133+ клітини, мають обмежену здатність реагувати на дію цитокінів. Але під час «дозрівання», тобто переходу стовбурових клітин на наступні ступені розвитку, їх здатність відповідати на дію цитокінів проявляється яскравіше. Причина такого феномену знаходиться у природі рекомбінантного ростового фактора Flt3/FLK2 (Sigma), відомого ще під назвою STK-1, stem cell tyrosme-kinase-1 чи CD135, який функціонує шляхом активації рецепторів c-kit і Flt3тирозинкінази. Виходячи з цього, призначення Flt3 зводиться, в першу чергу, до сприяння просуванню первісної популяції на наступні етапи розвитку, в результаті чого підвищується чутливість клітин до цитокінів, спостерігається накопичення функціонально активних нащадків стовбурової клітини, і, як наслідок, досягається високий рівень показників колонієутворення в культурі in vitro. Серед клітинних популяцій кордової крові, гетерогенність яких не викликає сумнівів, активніше на цитокіни реагують мононуклеарні клітини, серед яких знаходяться зріліші попередники. АС133+ клітини менше реагують на цитокіновий комплекс, тобто експансія їх у цих умовах значно менша. Але інкубація їх протягом 12-18 годин із Flt3 з подальшою заміною супернатанту і додаванням у культуру комплексу цитокінів у повному живильному середовищі підвищує як кількість ядровмісних кровотворних клітин, так і кількість колонієутворюючих одиниць. 16917 4 Вказана у способі, що заявляється, тривалість інкубації, тобто обробки клітин фактором Flt-3, є оптимальною і вибрана у зв'язку з тим, що до 12 годин ефект стимуляції функціональної активності кровотворних клітин-попередників при культивуванні кордової крові спостерігається незначний. Протягом 12-18 годин - максимальний. А у наступні після 18 годин (20 годин, 24 години) зменшується, і це може пояснюватися тим, що довший період інкубації без комплексу інших ростових факторів не сприяє росту числа колоній у культурі. Заявлений спосіб здійснюється таким чином. Кордову кров отримують під час пологів у здорових жінок віком від 20 до 30 років. Вилучення стовбурових клітин та клітин-попередників з кордової крові проводять за допомогою імуноселекції з використанням моноклональних антитіл до АС 133 (CD133) рецепторів [de Wynter E.A, Buck D., Hart C. e.a.CD 34+ AC133+ cells isolated from cord blood are highly enriched in long-term cultureinitiating cells, NOD-SCID-repopulating cells and dendritic cell progenitors // Stem cells. - 1998. - V.16, p.387-396]. Популяція AC 133+ вважається найбільш чистою популяцією ранніх проліферуючих кровотворних елементів, безпосередніх нащадків поліпотентної стовбурової клітини. Процедуру здійснюють за допомогою AC133+ антитілкон'югованих супермагнетичних мікронамистинок і Мінімакс-колонки (Miltenyi Biotec, Germany) протягом 30 хвилин при 4 C. Збагачені примітивними популяціями клітинні суспензії проводять через другу колонку, досягаючи очищення більш як на 90%. Далі проводять інкубацію очищених клітин кордової крові (AC133+) протягом 16 годин (12-18 годин) в умовах СО2 інкубатора при 37°С з ростовим фактором Flt3 з розрахунку, в даному випадку, 10нг на 1мл середовища. Після заміни середовища у культуру додають комплекс цитокінів, в даному випадку, LIF+ IL3+GM-CSF, у таких концентраціях: LIF 10нг/мл+IL3 10нг/мл, (інтерлейкін-3)+GM-CSF 10нг/мл (гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор). Цей протокол комбінації факторов і їх концентрації можуть бути зміненими в залежності від задач, що вирішуються. Після чого, клітини культивують у коміркових планшетах фірми NUNC (по 1х103 на кожну комірку) протягом 1-го тижня в умовах абсолютної вологості, 5% СО2 і температурі 37°С. Для постановки культуральних досліджень використовують живильне середовище RPMI (СІЛА), 15% фетальну телячу сироватку Sigma (США), рекомбінантні ростові фактори у приведених вище концентраціях, 10ммоль/л Hepes, 2ммоль/л глютаміна, 5х105/моль/л 2-меркаптоетанола, антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин по 50Од/мл). Суспензію культивованих клітин збирають в окремі пробірки і центифугують при 1000об/хв. протягом 5 хвилин у фосфатному буфері. Для оцінки наявності серед культивованих клітин нащадків стовбурових клітин їх культивують вже у інших умовах, а саме у напіврідкому агарі in vitro у коміркових планшетах фірми NUNC у прису 5 16917 тності ГМ-КСФ (10нг/мл) [Summers Y., Heyworth С., de Wynter E., Hart С. е.а. АС133+ G0 cells from cord blood show a high incidence of long-term cultureinitiating cells and capacity for more than 100 millionfold amplification of colony-forming cells in vitro // Stem cells. 2004 - V.22, P.704-715]. Визначають кількість комітованих колоній мієлоїдних попередників (грануломоноцитарних, гранулоцитарних, макрофагальних), які виростають за 10-14 днів. Кожна отримана колонія формується однією стовбуровою клітиною або її найближчим нащадком. В Таблиці наведені результати функціональної активності (ефективності колонієутворення) АС133+ клітин кордової крові в культурі in vitro, отримані при реалізації способу-найближчого аналога і способу, що заявляється, який включає процес інкубації з фактором Flt3. Для останнього наведені результати для 3-х прикладів його реалізації, коли термін інкубації містився у межах та поза межами часового інтервалу, що заявля 6 ється. Всі інші умови, наведені вище, для реалізації обох способів були однаковими. Результати показали, що ефективність колонієутворення AC133+ клітин при культивуванні у відповідності з заявленим способом у 7 разів перевищує дані, отримані при реалізації способунайближчого аналога. Таким чином, перевагою корисної моделі є розробка способу отримання високого рівня концентрації стовбурових клітин та їх найближчих нащадків (клітин-попередників) у очищеній фракції кордової крові (АС133+ клітин). Запропонований спосіб забезпечить більш ефективне культивування фракцій кордової крові і може успішно застосовуватись у лабораторіях для збагачення стовбуровими клітинами клітинної популяції, призначеної для алогенної трансплантації. Рішення цієї задачі тісно пов'язане з розвитком новітніх біотехнологій, зокрема, цитокінрегулюючих технологій, і має важливе народногосподарське значення. Таблиця Показник кордової крові Найближчий аналог Умови культивування суспензії клітин кордової крові Згідно з описом способу Колонієутворенння КУО-ГМ 31,3±1,5* Корисна модель, що заявляється Згідно з описом способу, при умові, коли термін інкубації з Flt-3 становив: до 12 год. 16 год. після 18год. 55,6±0,6 212,3±1,0* 180,2±1,5 Примітка: * - відмінність між порівнюваними показниками статистично достовірна (Р