Спосіб визначення фізичного стану розчину кріопротектора в процесі заморожування – відігріву

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при разработке режимов консервирования биологических объектов. Известен способ определения фазового состояния воды с помощью световой микроскопии, который основан на изменении оптической плотности жидкой фазы при ее кристаллизации или изменении вращения плоскости поляризации света [1]. Недостатком способа является невозможность непрерывной регистрации физического состояния исследуемого объекта в процессе его охлаждения - нагрева. Наиболее близким к заявляемому является способ определения фазового состояния биообъектов при криоконсервировании [2]. Согласно этому способу образец охлаждают до конечной температуры с постоянной скоростью, стабилизируют при конечной температуре в течение 10-15 мин, после чего прикладывают к нему внешнее деформирующее напряжение и отогревают, В процессе отогрева непрерывно регистрируют термопластическую деформацию образца. На основании полученных данных определяют температурные интервалы фазовых состояний биообъекта. Недостатки способа. 1. Не позволяет регистрировать физическое состояние исследуемого объекта в течение всего цикла замораживания -отогрева, т.к. в процессе охлаждения образец находится в жидкообразном состоянии и к нему нельзя приложить внешнее деформирующее напряжение. 2. Позволяет регистрировать только те физические состояния образца, которые связаны с изменением термопластических характеристик. Задачей изобретения является создание такого способа определения физического состояния раствора криопротектора в процессе замораживания -отогрева, в котором введение дополнительных исследований на этапе охлаждения позволяет регистрировать физические изменения образца, связанные не только с термопластическими, но и с объемными эффектами, и за счет этого получить более полную и достоверную информацию о физическом состоянии раствора криопротектора на различных этапах замораживания отогрева. Поставленная задача решается тем, что в способе определения физического состояния раствора криопротектора в процессе замораживания - отогрева, включающем охлаждение образца до конечной температуры, приложение к нему внешнего деформирующего напряжения и последующий отогрев с одновременной регистрацией термопластической деформации, параллельно в идентичном режиме охлаждают второй аналогичный образец, причем в процессе охлаждения регистрируют объемные изменения образца, и на основании данных, полученных для первого и второго образцов, судят о физическом состоянии раствора криопротектора на различных этапах замораживания - отогрева. Введение дополнительных исследований на этапе охлаждения, а именно регистрации объемных эффектов, позволяет проследить за эффектами, происходящими не только в процессе отогрева, но и охлаждения, и таким образом получить более полную информацию о физическом состоянии раствора криопротектора во всем диапазоне температур от комнатной до конечной и обратно. Одинаковый режим охлаждения (скорость, конечная температура) обеспечивает идентичность процессов, происходящих в обоих образцах, что повышает достоверность получаемой информации. Способ осуществляют следующим образом. Готовят водный раствор криопротектора заданной концентрации. Часть раствора помещают в ячейку устройства для термопластических исследований растворов [3], а часть - в рабочую камеру устройства для дилатометрических исследований [4]. Оба образца начинают одновременно охлаждать с одинаковой постоянной скоростью до одинаковой конечной температуры. В процессе охлаждения регистрируют дилатометрическую кривую образца, находящегося в устройстве для дилатометрических испытаний. При достижении образцами конечной температуры образец, находящийся в устройстве для термопластических испытаний, стабилизируют в течение 10-15 мин, прикладывают внешнее деформирующее напряжение, после чего начинают отогревать с постоянной скоростью, близкой к скорости охлаждения, до температуры плавления. В процессе отогрева регистрируют термопластическую кривую. По термопластической кривой определяют температурный интервал низкотемпературного эвтектического расслоения раствора при отогреве, а также температуру перехода образца в полностью твердофазное состояние. По дилатометрической кривой определяют температуру начала и конца кристаллизации образца и получают подтверждение того, что явление низкотемпературного эвтектического расслоения существует и на этапе охлаждения в том же температурном интервале, что и при отогреве образца. Способ поясняется следующим примером. Пример. Для эксперимента готовили 45%-ный водный раствор криопротектора полиэтиленоксида молекулярной массы 1500(ПЭО-1500). Часть раствора поместили в устройство для дилатометрических исследований, часть - в устройство для термопластических исследований растворов и начали одновременно охлаждать с постоянной скоростью 0,5 град/мин до -196°С. В процессе охлаждения регистрировали дилатометрическую кривую образца, находящегося в дилатометрическом устройстве. При достижении -196°С образец, находящийся в устройстве для термопластических исследований, стабилизировали в течение 10 мин, после чего к нему приложили деформирующее напряжение 20 г/мм' и начали отогрев с постоянной скоростью 1 град/мин до температуры расстеклования образца (-20°С). В процессе отогрева регистрировали термопластическую кривую. На чертеже показаны дилатометрическая кривая 1 и термопластическая кривая 2. Кривая 1 показывает изменение объема образца в процессе охлаждения, кривая 2 -изменение пластической деформации образца в процессе отогрева в зависимости от его температуры при постоянной внешней нагрузке. По кривой 1 определяли температуру начала и конца кристаллизации образца, а также температурные интервалы низкотемпературного эвтектического расслоения при охлаждении. По кривой 2 определяли температуру перехода образца в полностью твердофазное состояние, а также температурные интервалы низкотемпературного эвтектического расслоения при отогреве. При анализе обеих кривых получили следующие температурные интервалы физических процессов, протекающих в растворе криопротектора ПЭО-1500 при замораживании - отогреве. Первый этап - от комнатной температуры 20°С до температуры начала кристаллизации -22°С сопровождается монотонным уменьшением объема образца с понижением температуры (кривая 1). Второй этап охлаждения от температуры начала кристаллизации -22°С до температуры начала эвтектического расслоения раствора при охлаждении -48°С (кривая 1). Третий этап - температурный интервал протекания низкотемпературного эвтектического расслоения раствора при охлаждении или нагреве. При низкотемпературном эвтектическом расслоении раствора идет образование двух новых фаз: сшивка ассоциатов из молекул криопротектора и образование микрокристаллов льда за счет появляющихся вблизи ассоциатов свободных молекул воды. Процесс образования ассоциатов из молекул криопротектора ведет к повышению вязкости раствора и отчетливо выделяется на термопластической кривой на отогреве характерным плато в интервале температур -60 - -28°С. А объемные эффекты, сопровождающие образование микрокристаллов льда, а кинетика их протекания отчетливо отображены на дилатометрической кривой охлаждения образца в интервале температур -47- -60°С. Необходимо отметить, что эффект низкотемпературного эвтектического расслоения растворов имеет значительную асимметрию по отношению к знаку изменения температуры: скорость процесса ассоциации молекул криопротектора в режиме охлаждения раствора значительно ниже скорости этого процесса при нагреве раствора в тех же интервалах температур. Асимметрия эффекта объясняется влиянием вязкости среды на энергию активации процесса сшивки молекул криопротектора. Четвертый этап наступает при температуре -76°С, когда образец переходит в полностью твердофазное состояние и на термопластической кривой образуется плато, которое говорит о том, что приращение деформации образца Δε=0 происходит благодаря высокой стабильности структуры образца в диапазоне температур -75-196°С. Знание температурных интервалов протекания физических процессов в замораживаемых-отогреваемых растворах криопротекторов имеет большое значение для экспериментальной и практической криобиологии, т.к. уменьшая или увеличивая в зависимости от природы явления скорость прохождения криоконсервируемой биосистемой таких температурных интервалов, можно оптимизировать технологию криоконсервирования путем уменьшения влияния на них повреждающих факторов описанных эффектов.