Штам бактерій аlсаlіgеnеs раrаdохus девис кфгм із уаан n 060207, що використовується для виробництва бактеріального добрива під рис та пшеницю

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к средствам повышения урожая риса и пшеницы. В качестве прототипа принят штамм бактерий Agrobacterlum radlobacter 204 (авт. св. СССР № 162 1433 С 05 F 11/08 кл. С 12 № 1/20, депонированный в коллекции ВНИИСХМ под номером 31). Штамм бактерий Agrobacterium radiobacter 204 выделен из почвы ризосферы риса на пластинках кремнекислого геля, пропитанных средой Виноградского без азота. Штамм позволяет увеличить урожай пшеницы на 2 ц/га и различных сортов риса на 1,9-3,7 ц/га. Штамм Agrobacterium radlobacter 204 имеет следующие культурально-морфологические признаки. Суточная культура бактерий представляет собой палочки 0,8х 1,5-3,0 мкм, подвижные, с латеральным прикреплением жгутиков, неспорообразующие, граммотрицательные. На твердых средах (бобовый агар, ΜΠ Α) образуют обильные полисахаридные слизи, колонии бесцветные, не пигментированы, гладкие. На агаровой безазотной среде Виноградского при плотном посеве рост сплошной, поверхность гладкая, колонии бесцветные. Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, но способен расти при пониженном содержании кислорода. Температурный оптимум 23-32°С, рН 5,8-9,0. Растет в пределах рН 5,0-12,0 и температуры 5-40°С. Отношение к источникам углерода; хорошо растет на глюкозе, сахарозе, фруктозе, лактозе, манните, сорбите, дульците, крахмал, целлюлозу использует слабо, агар не использует. Сбраживает простые углеводы с образованием кислоты и СС*2. Реакция замаскирована образованием щелочных ве ществ. Отношение к источникам азота: использует минеральные и органические формы азота - нитраты и соли аммония, аминокислоты, однако может обходиться без них. При росте на безазотной среде Виноградского фиксирует азот атмосферы. Казеин не гидролизует. Желатину не разжижает, молоко не свертывает. Содержание гуаминцитозина (ГЦ) в ДНК 61,4%. Нитрогенззная активность 148·10 мкг азота на 1 мл среды в сутки. Причинами, препятствующими достижению технического результата (производства высокоэффективного биоудобрения) является низкая ферментативная активность штамма прототипа, недостаточная стабильность получения устойчивых показателей при применении в посевах пшеницы и риса. В основу изобретения поставлена задача селекции штамма бактерий, способного связывать азот атмосферы в ассоциации с растением и используемого для производства эффективного биоудобрения, повышающего урожайность пшеницы и риса. Поставленная задача решена путем селекции из ризосферы риса выращиваемого в монокультуре без минеральных удобрений нового высокоэффективного штамма Alca-ligenes paradoxus Де вис КФПМ ИЗ УААН. Новый штамм Alcaligenes paradoxus Девис КФПМ ИЗ УППН № 060207 получен модифицированным методом накопительных культур для выделения симбиотрофных азотофиксирующи х микроорганизмов. Селекционированный штамм Alcaligenes paradoxus имеет следующие, совпадающие со штаммомпрототипом свойства. Штаммы Agrobacterium radiobacter 204 и Alcaligenes paradoxus № 060207 выделены из почвы ризосферы риса на кремнекислых гельных пластинках, пропитанных средой Виноградского без азота. Бактерии подвижны, имеют латеральное прикрепление жгутиков, неспорообразующие, граммотрицательные. На твердых средах (бобовый агар, ΜΠ Α) колонии гладкие. Аэробы. В качестве источника азота используют минеральные и органические формы азота. Как источник углерода, хорошо использует различные формы углеводов: глюкозу, фр уктозу, лактозу, мальтозу и др. Штаммы Agrobacterium radiobacter 204 и Alcaligenes paradoxus 060207 способны фиксировать азот атмосферы благодаря наличию фермента нитрогеназы. В отличии от штамма бактерий Agrobacterium radiobacter 204, имеющего нитроге-назную активность 148*10-3 мкг азота на 1 мл среды в сутки, Alcaligenes paradoxus 060207 способен фиксировать 1017-Ю'3 мкм азота на 1 мл среды в сутки за счет высокой ферментативной активности. Нитрогеназную активность штаммов Agrobacterium radiobacter 204 и Alcaligenes paradoxus 060207 определяли методом ацетилен редукции на газовом хроматографе "Хром-5". Штаммы имеют следующие отличительные морфологические признаки. Штамм Alcaligenes paradoxus 060207 на бобовым агаре образует колонии желто-оранжевого цвета за счет внутриклеточного пигмента каротиноидной природы. Колонии Agrobacterium radiobacter 204 на тех же средах бесцветны. Суточные культуры обоих штаммов представляют собой палочки, размеры которых различны. Палочки штамма 060207 имеют размеры 0,5x1,5-2,5 мкм, палочки штамма 204 более крупные - 0,8x1,5-3,0 мкм. Экспоненциальная фаза роста штамма Alcaligenes paradoxus 060207 достигает максимума через 30 часов, тогда как Agrobacterium radiobacter 204 через 36 часов. Новый штамм быстрее растет, что упрощает получение препаративной формы в производстве. Между совокупностью отличительных признаков штаммов Alcaligenes paradoxus 060207 и Agrobacterium radiobacter 204 существует следующая причинно-следственная связь: технический результат будет достигн ут в штамме 060207, имеющем указанную и вышеперечисленную совокупность признаков, при отсутствии этих признаков технический результат достигнут не будет. Характеристика штамма бактерий Aicaligenes paradoxus 060207. Номенклатурные данные: род Alcaligenes, вид Alcaligenes paradoxus депонирован под № 060207 в коллекции КФПМ ИЗ УААН. Происхождение штамма: штамм Alcaligenes paradoxus 060207 выделен из ризосферы монокультуры риса в ЭСХ "Красное" Краснодарский край. Способ выделения: штамм Aicaligenes paradoxus 060207 выделен на кремнекислых гельных пластинках, пропитанных безазотной средой Виноградского, Шерстобоевым Н. К., Дудиновой И. Α., Шерстобоевой Е. В., Патыкой В. Ф„ Мельник Л. И., ими же штамм идентифицирован по определителю Берги, 1984 г., сравнен с типовым штаммом бактерий Agrobacterium radiobacter 204, задепонироеанным в коллекции ВНИИСХМ под №31. Биотехнологическая характеристика. Штамм бактерий Alcaligenes paradoxus 060207 благодаря наличию фермента нитрогеназы, обеспечивающего эзотфиксирующую активность штамма 1017 х 10 мкг азота на 1 мл среды в сутки, способен фиксировать азот атмосферы. Среды, обеспечивающие максимальный уровень полезного свойства готовят по прописи: полужидкая среда Доберейнер. Нитрогеназную активность определяли методом ацетилен редукции на хромотографе "Хром-5". Культурально-морфологические признаки. Суточная культура бактерий Alcaligenes paradoxus 060207 представляет собой палочки 0,5x1,5-2,5 мкм с латерально-расположенными жгутиками подвижные, грамм-отрицательные, не спорообразующие. Бактерии культивируют при температуре 25-30°С в следующи х питательных средах бобовый агар, безазотная среда Виноградского. На твердых средах колонии гладкие, желтого цвета, слизистые, клетки подвижные, желтый пигмент каратиноидной природы, в среду пигмент не выделяется. Жидкая среда готовится по прописи: жидкая гороховая среда, бактерии культивируются при температуре 28-30°С, при аэрации 150 об/мин. Лучший те хнологический результат отмечен при использовании культуры в возрасте 30-42 часа, Среда мутнеет, приобретает лимонно-желтую окраску, слабо подкисляется, имеет специфический запах. Физиолого-биохимические свойства. Бактерии Alcaligenes paradoxus 060207 являются хемоорганотрофами. В ассоциации с растением фиксируют азот атмосферы, являются аэробами, температура культивирования минимальная 25°С, максимальная 30°С, оптимальная 28°С, рН 6-7,5, оптимальная 7,0-7,2. В качестве источника углерода использует многие простые углеводы, в промышленном производстве препарата на основе нового штамма в качестве питательных добавок используется меласса. В качестве источника азота использует минеральные и органические формы азота, нитраты и соли аммония. При росте на безазотных средах фиксирует азот атмосферы. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Индол и ацетон не образует. Содержание гуанинцитозина (ГЦ) в ДНК 72,6%. Штамм хранят на безазотной среде Виноградского рН 7,0-7,2 при 4°С, периодичность пересева 2-3 мес. Признаки штамма устойчивы. Нитрогеназная активность составляет 1017x10 мкг азота на 1 мл среды в сутки, активность не снижается в процессе хранения штамма на твердой среде Виноградского в течение шести месяцев. Штамм используется для приготовления препаратов Приготовление препаратов на твердом субстрате (лигнин, торф). Торф и лигнин фасуют в пакеты по 750 гр (0,5 гв/п) нейтрализуют, увлажняют и подвергают гаммастерилизации (доза 2-5 Μ рад). Для инокуляции готовят жидкую рабочую среду, которую инокулируют в зависимости от объема (плотность посева 0,2-0,5 млрд/кл). Торф инокулируют (уколом) и затем выдерживают при комнатной температуре (12-25°С) для получения титра не менее 9 млрд/кл. Для инъекций готовят инокуляционную среду (50% культуры, 50% добавок). Обработку семян риса и пшеницы проводят в день посева, а еще лучше небольшими партиями непосредственно перед посевом. Предпосевную обработку семян биопрепаратом производят вручн ую на брезенте и механически в чистой протравочной машине. Ручн ую обработку (инокуляцию) семян торфяным биопрепаратом Alcaligenes paradoxus 060207 осуществляют следующим образом: на брезент насыпают семена риса (пшеницы) в количестве соответствующем 1 или 2 гектарным порциям высева, и обрабатывают поверхность рабочей смесью препарата. Рабочую смесь готовят путем размешивания гектаропорции (300 г) в 1,5 л воды или прилипателя до разрушения комочком торфа, затем семена перемешивают поочередно поднимая противоположные концы брезента для равномерного распределения препарата на поверхности семян. Обработанные биопрепаратом семена затаривают в мешки и вывозятся в поле для посева. Ме ханизированную обработку семян биопрепаратом осуществляют машинами для протравливания семян по технологии, аналогичной с протравливанием, для этой цели пригодны ПСШ-3, ПС-10 и другие. Перед работой машины для протравливания необходимо тщательно очистить от ядохимикатов, промыть и обезвредить согласно санитарным правилам. Для лучшей удерживаемости биопрепарата на поверхности семян злаковых культур необходимо использовать прилипатели, дозировка которых дифференцируется в зависимости от препарата. Применяют следующие водные концентрации препаратов 7-12%-ный раствор барды, 1-1,5%-ный раствор казеина технического, 2-3%-ный раствор латекса или патоки, 2-2,5%-ный раствор натриевой соли, карбоксиметилцеллюлозы технической (натрий КМЦ), снятое молоко (обрат) используют для разбавления. Πример 1. Сравнительные испытания эффективности Agrodacterlum radlobacter 204 и Aicaligenes paradoxus 060207, проводили в вегетационных опытах в сосудах, вмещающих 6 кг почвы, в 6-кратной повторно-сти. Почва южный чернозем с содержанием гумуса-2,2%, легкогидролизуемого азота - 3.0 мг/100 г почвы Р2О5 - 1,9 мг/100 г почвы обменного калия 33 мг/100 г. почвы. Пример 2. Сравнительные испытания эффективности Alcaligenes paradoxus 060207 и Agrobacterium radiobacter 204 проводили в производственном опыте на базе Скадовской опытной станции риса. Пример 3. Сравнительные испытания эффективности Aicaligenes paradoxus 060207 и Agrobacterium 204 в полевом опыте с озимой пшеницей на базе Мироновского НИИ селекции и семеноводства пшеницы. Хранят препарат при температуре 8-12°С в сухом проветриваемом помещении, отдельно от ядохимикатов.