Спосіб визначення локальної пухлинної імуносупресії шляхом дослідження в клітинах пухлини супресивних цитокінів методом полімеразно-ланцюгової реакції (плр)

Спосіб визначення локальної пухлинної імуносупресії шляхом дослідження в клітинах пухлини супресивних цитокінів методом полімеразно 3 17905 Спосіб Жданова А.В. і співавт. (2002) [3], з одного боку, описаний для гістологічно іншого типу клітин, а з іншого - потребує використання високоочищених рекомбінантних реагентів та високотехнологічного устаткування іноземного виробництва, що диктує високий кошторис таких досліджень і обмежує широке застосування цього способу у клініці. Завданням корисної моделі було створення способу визначення локальної пухлинної імуносупресії за експресією мРНК супресивних цитокінів в клітинах пухлин мозку, який адекватно відображав би процеси, що відбуваються при пухлинному процесі in vivo в організмі хворого, а також був відносно економічним, малозатратним і широкодоступним. Поставлене завдання було вирішене завдяки тому, що у способі визначення локальної пухлинної імуносупресії, який включає виділення клітин у клітинну суспензію з тканини пухлини, виділення з клітин РНК, переведення РНК у ДНК в реакції зворотної транскрипції, проведення ПЛР, проведення електрофорезу отриманих ампліфікованих зразків, використовують свіжо виділені клітини пухлини, щойно видаленої під час оперативного втручання, і специфічні праймери для проведення ПЛР для IL-10 і TGF- . Використання свіжо виділених клітин пухлини, щойно видаленої під час оперативного втручання, і специфічних праймерів для проведення ПЛР для IL-10 і TGF- , надає можливість адекватного відображення здатності пухлини до локальної імуносупресії через продукцію імуносупресивних цитокінів, 4 а використання реагентів і устаткування виробництва Росії ("Изоген", "ДНК-технология") робить пропонований спосіб відносно економічним і широкодоступним. Спосіб відтворюють наступним чином: в стерильних умовах нативну щойно видалену під час оперативного втручання тканину пухлини переносять у фізіологічний розчин, подрібнюють і суспендують шприцом з товстою голкою. Отриману суспензію відмивають фізіологічним розчином 5хв. при 1500об/хв. Кількість клітин у суспензії доводять до 5х106 клітин в 0,1мл. РНК виділяли із суспензії за допомогою набору "РНК-сорб" (АмплиСенс, Центральний НДІ епідеміології МЗ РФ). РНК переводили у кДНК в реакції зворотної транскрипції і далі проводили ПЛР за допомогою набору "RT-PCR core" ("Изоген", Росія). ПЛР проводили з використанням 0,2мкМ праймерів (синтетичних олігонуклеотидів) (Таблиця 1) протягом 35 циклів з параметрами: 95°С - 15с, 58-62°С - 20с, 72°C - 15с в термоциклері "Терцик" ("ДНК-технология", Росія). Результати PCR аналізували за допомогою електрофорезу у 2,0% агарозному гелі з використанням спеціалізованої системи для обробки відеозображень "Biotest-A". Наявність мРНК вважали доведеним у тих зразках, у яких в результаті електрофорезу в 2,0% гелі спостерігалась світна смуга заданої довжини при відсутності такої смуги у негативному контролі. З метою стандартизації отриманих результатів проводили RT-PCR з використанням праймерів, специфічних до гена -актину людини, що експресується конститутивно. Таблиця 1 Використані в роботі праймери ("SYNTOL", Росія) мРНК -актин TGF- 2 IL-10 Нуклеотидна послідовність (5' -3') С: AGGCCAACCGCGAGAAGATGAC A: TCGGCCGTGGTGGTGAAGC C: GCGTGTCCCAAGATTTAGAACC A: TCAAGTGAGGCGCGGGATAGG C: GTGGAGCAGGTGAAGAATGCCTT A: TATCCCAGAGCCCCAGATCCGAT При застосуванні описаного способу визначення експресії мРНК IL-10 і TGF методом ЗТПЛР при дослідженні зразків (n=37) свіжовиділених клітин пухлин головного мозку різного гістогенезу встановлено, що мРНК IL-10 експресована в 15 зразках (40,5%), а мРНК TGF- - в 11 зразках (29,7%) клітин пухлин. При цьому 2 зразки (5,4%) експресували одночасно мРНК IL-10 і TGF- , а загальна кількість зразків, які експресували мРНК IL-10 і/або TGF- , становила 23 (62,2%). Таким чином, більшість досліджених зразків свіжовиділених клітин пухлин головного мозку експресує мРНК імуносупресивних цитокінів IL-10 і/або TGF- , що відображає здатність цих пухлин до локальної імуносупресії в мікрооточенні пухлини in vivo. Використання пропонованого способу визначення локальної пухлинної імуносупресії в нейрохірургії і нейроонкології дозволить прогнозувати Довжина амплікона, пар нуклеотидів 278 515 201 перебіг онкологічної і нейрохірургічної патології і буде критерієм для призначення імунотерапії у даної категорії хворих. Список літератури: 1. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Система иммунитета и рак: достижения и неудачи // Онкология.2003.-Т.5, №2.-С.84-89. 2. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Иммунология злокачественного роста.-К.: «Наукова думка», 2005.-791с. 3. Жданов А.В., Сосулина Л.Ю., Курбанова Д.Ф. и др. Экспрессия генов цитокинов мононуклеарными клетками крови женщин с гнойновоспалительными заболеваниями придатков матки // Бюлл.экспер.биол.мед.-2002.-Т.134, №11.С.555-559. 4. Dix A.R., Brooks W.H., Roszman T.L., Morford L.A. Immune defects observed in patients with 5 17905 primary malignant brain tumors // J.Neuroimmunol.1999.-100(1-2):216-32. 5. Hishii M., Nitta t., Ishida h. et al. Human glioma-derived interleukin-10 inhibits antitumor immune responses in vitro // Neurosurgery.-1995.37(6): 1160-6. 6. Itoh S., Itoh F., Goumans M.J., ten Dijke P. Signaling of transforming growth factor-beta family members through Smad proteins // Eur.J.Biochem.2000.-V.267.-P.6954-6967. Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 7. McCutcheon I.E., Fluvberg A., Hill H. et al. Antitumor activity of the growth hormone receptor antagonist pegvisomant against human meningiomas in nude mice // J.Neurosurg.-2001.-V.94.-P.487-492. 8. Miyazono K., ten Dijke P., Heldin C.-H. TGFbeta signaling by Smad proteins // Adv.Immunol.2000.-V.75.-P.115-117. 9. Moustakas A., Souchelnytsky S., Heldin C.-H. Smad regulation in TGF-beta signal transduction // J.Cell Sci.-2001.-V.114.-P.4359-4369. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601