Спосіб ідентифікації кднк штамів вірусу високопатогенного пташиного грипу типу н5 за ампліфікацією специфічної ділянки на гені

Спосіб ідентифікації кДНК штамів вірусу високопатогенного пташиного грипу типу Н5 за ампліфікацією специфічної ділянки на гені, що включає 3 18727 4 вірусу в ньому на рівні 2log2, що відповідає за чутПриготування агарозного гелю. У конічну колливістю світовим аналогам та відповідає критерію бу ємністю 250см3 вносять вміст одного пакета з "новизна". агарозою, додають 100,0см3 робочого розчину Пробопідготовка. буфера ТБЕ і ставлять колбу на водяну баню. Як матеріал для дослідження використовують Вміст колби доводять до кипіння і після того, як екстраембріональну рідину від інфікованих куряагароза повністю розтопиться (через 10-15 хвичих ембріонів, кров, органи, назальні та клоакальні лин), колбу з розтопленою агарозою знімають. змиви від хворої та підозрілої в захворюванні на Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим BППГ птиці. Проби крові стабілізують 1:10 10% і не вміщувати окремих нерозчинених часток. розчином цитрату натрію, органи гомогенізують Розтоплену агарозу охолоджують при кімнатмеханічними методами та розводять 1:10 розчиній температурі до температури 50-60°С, вносять ном Хенксу з 10000ОД/см3 канаміцину сульфату. 50,0мкл розчину броміду етидія і ретельно переЕкстракція загальної РНК проводиться за домішують вміст колби обертовими рухами. помогою набору для екстракції загальної РНК РИВ електрофоретичну камеру заливають необБО-Сорб (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогіхідну кількість розчину буфера ТБЕ товщиною 4чного. Процедура складається із лізису клітин та їх 5мм. Для нанесення проби відбирають 10мкл продетриту, сорбції РНК на сорбенті, чотириразового дукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку відмивання сорбованої ДНК та екстракції РНК із агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ. Електросорбенту за допомогою DEPS-елюенту. форез проводять у градієнті напруги 8 В/см до кДНК вірусу отримують шляхом зворотної тратого моменту, як барвник відійде від лінії старту на нскрипції РНК за допомогою набору для прове2,0-3,0см. Агарозний гель поміщають на скло УФдення зворотної транскрипції «PEBEPTA-L» (Амптрансілюминатору і аналізують отримані результалисенс, Москва, Росія), або аналогічного, згідно ти. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у протоколів виробників. Синтез кДНК базується на вигляді смужок жовтогарячого кольору при прохоревертазозалежній полімерізації +ДНК-ланцюгів на дженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі РНК-матриці. 310нм. Ампліфікація. Облік результатів. Готують загальну суміш реагентів для ампліУ негативному контрольному зразку (К-) смужфікації з розрахунку (на 1 пробу): ки повинні бути відсутні. Поява смужки на рівні деіонізованої води 20,0мкл; позитивного контролю свідчить про контамінацію 2,0мкл 50мМ Mg++; (забруднення) компонентів набору. реакційного буферу 10,0мкл; У позитивних контрольних зразках (К+) повинсуміші dNTP 5,0мкл; на виявлятися одна смужка жовтогарячого кольопраймера Aiv-H5-F 1мкл; ру розміром 487 нуклеотидний залишок (н.з.). праймера Aiv-H5-R 1мкл; Відсутність смужки жовтогарячого кольору на Taq-полімерази 1мкл. рівні позитивного контролю (К+) (487н.з. для перПісля додавання Taq-полімерази, що провошого етапу ПЛР) свідчила про відсутність вірусу диться у останню чергу, суміш ретельно переміВППГ Н5-субтипу в пробі, що аналізували. шують на вертексі. В усі пробірки, підготовлені для Наявність смужки, що відповідає за електроампліфікації додають по 40мкл ампліфікаційної форетичною рухливістю позитивному контролю суміші, а потім додають по 1 краплі (близько (487н.з.), свідчить про присутність вірусу ВППГ Н520мкл) мінерального масла. Після чого у відповідсубтипу в пробі, що аналізували. ну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла Результат аналізу не можна вважати достовівносять 10мкл розчину загальної кДНК проби. рним, якщо на доріжці будь-якого негативного конДля негативного контрольного зразка вносять тролю виявляється специфічна смужка. в прбірку - 10мкл деіонізованої води, а для позитиЕфективність способу розкривається в приквного контрольного зразка вносять - 10мкл розчиладах. ну к ДНК з інактивованої формаліном екстраембПриклад 1. Для оцінки чутливості способу щоріональної рідини курячих ембріонів, інфікованих до ідентифікації кДНК вірусу ВППГ субтипу Н5, поштамом Influenza virus перше, вивчили можливість виявлення різної кільA/chicken/Sivash/02/06/H5N1. Пробірки закривають кості специфічної кДНК. Для цього використовувай центрифугують 3-5 секунд при 2000об/хв, після ли зразки кДНК з проб вірусовміщуючої екстраемчого пробірки переносять в нагрітий до температубріональної рідини, з активністю в реакції ри 95°С програмний термостат (ампліфікатор) і гемаглютинації (РГА) від 1 до 12 log2. З'ясовано, проводять ампліфікацію за наступною програмою що запропонований спосіб здатен виявляти навіть (табл.): кДНК вірусу з титром 2 log2. Така мінімальна конПісля закінчення реакції пробірки передають центрація вірусу спостерігалась в гомогенатах для аналізу продуктів ПЛР, який проводять подіпатологічного матеріалу із органів, де активність лом фрагментів ДНК в агарозному гелі. вірусу ВППГ під час інфекції була найменшою. Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Отже, чутливість методу дозволяла детектувати Для приготування робочого розчину буфера специфічну кДНК вірусу ВППГ в будь-якому клініч(ТБЕ) для електрофорезу, в мірну колбу ємністю ному матеріалі. 1000,0см3 вносять вміст пакета з буфером, довоПриклад 2. Для визначення специфічності дять до мітки дистильованою водою та ретельно способу було використано 5 проб клінічного матеперемішують до повного розчинення осаду. ріалу від інфікованих ембріонів та курей, і 5 інтактних (2 група). 5 18727 6 Для контролю специфічності способу викорисвакцини) також не утворювали специфічних смуг товували зразки кДНК з курячих ембріонів, інфікопісля реакції за способом, що пропонується. ваних штамом Ла-Сота вірусу ньюкаслської хвоТаким чином, розроблено високочутливий роби, УМ-93 вірусу хвороби Гамборо та штамами спосіб ідентифікації кДНК вірусу ВППГ на основі вірусу грипу А, які не відносяться до Н5-субтипу та ампліфікації специфічної для Н5-субтипу ділянки входять до складу живої «Грипозної вакцини» (МіНА-гену, який може успішно використовуватись у кро ген, Росія). практиці лабораторних досліджень. Після ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг у 5 пробах клінічного матеріалу та Таблиця екстраембріональної рідини, а також в треку позитивного контрольного зразку кДНК вірусу ВППГ. № Температура Час Кількість циклів Проби кДНК з клінічного матеріалу від здорових циклу курей та інтактних ембріонів після ампліфікації не 1 95°С 2хв 1 давали смуг ампліконів. 95°С 1хв Проби сумарної кДНК гетерогенних контролів 2 58°С 1хв 30 (сумарна кДНК від курячих ембріонів, інфікованих 72°С 1хв штамом Ла-Сота вірусу ньюкасльської хвороби, 3 72°С 2хв 1 УМ-93 вірусу хвороби Гамборо та вірусами грипу інших субтипів які входять до складу грипозної Комп’ютерна верстка В. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601