Спосіб індикації днк патогенних штамів вірусу хвороби марека першого серотипу

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб індикації ДНК патогенних штамів вірусу хвороби Марека першого серотипу, що включає використання як ПЛР(полімеразної ланцюгової реакції)-мішені гена онкопротеїну Meq, який відрізняється тим, що ампліфікують фрагмент гена Meq довжиною 286/260 пар нуклеотидів за допомогою nested-ПЛР, на першому етапі детектують ДНК ВХМ-І, а на другому - ДНК онкогенних штамів ВХМ-І.

Текст

Спосіб індикації ДНК патогенних штамів вірусу хвороби Марека першого серотипу, що включає використання як ГІПР(полімеразної ланцюгової реакції)-мішені гена онкопротеїну Meq, який відрізняється тим, що ампліфікують фрагмент гена Meq довжиною 286/260 пар нуклеотидів за допомогою nested-ПЛР, на першому етапі детектують ДНК ВХМ-І, а на другому - ДНК онкогенних штамів ВХМ-І. Корисна модель, що передбачається, відноситься до ветеринарної вірусології, зокрема до розробки молекулярно-генетичних способів діагностики хвороби Марека на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Хвороба Марека (ХМ), що вперше описана Ж. Мареком у 1907 році, по цей час лишається актуальною проблемою птахівництва всіх країн. Щорічні загальносвітові збитки від цього захворювання сягають близько 1млрд. доларів. Для її діагностики запропонований ряд тестів, які успішно використовують у практиці ветеринарної медицини: реакція дифузійної преципітації (РДП, AGP), імунофлуоресценції та непрямий її варіант, різноманітні модифікації імуноферментного методу [ОІЕ. Manual standards of diagnostics and prophylaxis for animal disease, 2004]. Вірус хвороби Марека (ВХМ) класифіковано на три серотипи. Перший серотип вміщує всі патогенні штами та їх атенуйовані варіанти, а другий усі апатогенні. До третього серотипу відноситься неонкогенний вірус герпесу, виділений від здорових індиків, антигенне споріднений з ВХМ. Штами першого серотипу мають різну онкогенність. Доведено, що їх можна класифікувати за ступенем необластичних уражень в організмі інфікованих курчат. За такою класифікацією ВХМ підрозділяється на чотири патогенетичні типи (патотипи): слабко вірулентний (m - mild), вірулентний (v - virulent), дуже вірулентний ( w - very virulent), дуже вірулентний плюс чи надвірулентний (vv + - very virulent plus). Крім патотипізації, зараз запропонована нейропатотипізація, що складається з визначення патотипу і оцінки макроскопічних та мікроскопічних уражень нервової тканини. І за глибиною цих змін штами класифікують на групи А, В і С. Тому індикація саме штамів першого серотипу є першочерговою діагностичною задачею. Протягом останнього десятиріччя значну увагу приділяють вивченню біологічних властивостей збудника та розробці молекулярно-генетичних методів діагностики інфекційних захворювань, в т.ч. і ХМ. Найбільшої уваги та науково-практичного визнання заслуговують методи ПЛР, рестрикційноензимного аналізу та секвенсного аналізу ділянок геному різних збудників [Becker Y. et al., 1992; Tulman E. et al., 2000; Lee S.I., 2000; Горбовицкая М., 1996]. Наприклад, метод ПЛР для діагностики хвороби Марека і типізації штамів вірусу запропонований більше ніж у десяти країнах світу. Реакція є досить простою у виконанні, дуже чутлива та дозволяє отримати результат за короткий проміжок часу [Vathsala M., 2001; Davidson I., 1995]. Ген онкопротеїну Meq властивий лише для геному першого серотипу ВХМ. Він обумовлює онкогенні властивості вірусу та має високо консервативний нуклеотидний склад. Його використання як ПЛР-мішені для диференціації патогенних і апатогенних штамів ВХМ, було запропоновано Lee S.I. [Difference in the meq gene between oncogenic and attenuated strains of Marek's disease virus serotype I/ Lee S.I., Takagi M., Ohashi K., Sugimoto C, Onuma M.//J. Vet. Med. Sci. - 2000. - 62(3). - P.287-92], при ампліфікації ДНК-продукту, фланкованого праймерами у разі наявності геному патогенного штаму ВХМ-І утворюється амплікон довжиною ЮООп.н., а вакцинного - 1200п.н., це рішення може бути про 00 00 О) 7889 тотипом Недоліком прототипу є нижча чутливість за метод, що пропонується, та неспроможність до диференціації штамів в разі їх попереднього пасажування в культурах клітин В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб індикації ДНК патогенних штамів вірусу хвороби Марека першого серотипу, що містить використання як ПЛР-мішені гену онкопротеїну Meq шляхом ампліфікації 286/260п н фрагменту гену Meq за допомогою nested-ПЛР на першому етапі якої проводиться індикація ВХМ-І, а на другому онкогенних штамів ВХМ-І, щоб забезпечити спосіб індикації ДНК патогенних штамів вірусу хвороби Марека першого серотипу Спосіб виконується наступним чином Пробопідготовка Як матеріал для дослідження використовують селезінки хворої та підозрілої в захворюванні на хворобу Марека птиці їх гомогенізують механічними методами та розводять 1 10 розчином Хенксу з ЮООООД/см3 канаміцину сульфату Екстракція загальної ДНК проводиться за допомогою набору для екстракції загальної ДНК DNA Sorb-B (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогічного Процедура складається із лізису спленоцитів та їх детриту, сорбції ДНК на сорбенті, триразового відмивання сорбованої ДНК та екстракції ДНК із сорбенту за допомогою ТЕ-буферу Ампліфікація Готують загальну (для усієї КІЛЬКОСТІ проб) суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на 1 пробу) 15,0мкл деюнізованої води, 5,0мкл реакційного буферу, 2,0мкл суміші dNTP, 1мкл праймера MDV-1 (MDV-3 для nestedампліфікацп), 1мкл праймера MDV-2 (MDV-4 для nestedампліфікацп), 0,5мкл Taq-полімерази Після додавання Taq-полімерази, що проводиться у останню чергу, необхідно ретельно перемішати суміш на вортексі Додають по 25мкл ампліфікаційної суміші в усі пробірки, підготовлені для ампліфікації Додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 20мкл) мінерального масла Вносять 5мкл розчину загальної ДНК проби у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла для проведення ампліфікації Вносять в пробірку для негативного контрольного зразка - 5мкл деюнізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразка - 5мкл розчину ДНК культури фібробластів курячих ембріонів, інфікованої ВХМ І серотипу штаму BelGer-1 зі складу набору Пробірки закривають й центрифугують 3-5 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі Переносять пробірки в нагрітий до температури 94°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл ) Після закінчення реакції пробірки передають у кімнату №3 для аналізу продуктів ПЛР, який проводять поділом фрагментів ДНК в агарозному гелі Електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР Робота з амплифікованою ДНК повинна проводитись в окремій кімнаті лаборантом або спів робітником лабораторії, які не працюють у передПЛР приміщенні Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу В мірну копбу ємністю 1000,0см вносять вміст пакета з буфером для електрофорезу, довести до мітки дистильованою водою та ретельно перемішати до повного розчинення осаду Приготування агарозного гелю У конічну колбу ємністю 250см 3 вносять вміст одного пакета з агарозою, додати 100,0см3 робочого розчину буфера ТБЕ і поставити колбу на водяну баню Доводять вміст колби до кипіння і після того, як агароза повністю розтопиться (через 10-15 хвилин), колбу з розтопленою агарозою зняти з плитки (Якщо використовується електроплитка, вміст колби необхідно періодично перемішувати скляною паличкою, щоб запобігти пригорянню агарози) Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщувати окремих нерозчинених часток Розтоплену агарозу при кімнатній температурі охолодити до температури 50-60°С У колбу з розчином агарози внести 50,0мкл розчину броміду етидія, ретельно й обережно перемішують вміст колби рівномірними обертовими рухами Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю Встановлюють гребінку (можна встановити 2 і навіть 3 гребінки, залежно від КІЛЬКОСТІ проб для аналізу) на платформу Гребінки розміщують на відстані не ближче 3 см одна від одної Охолоджену до температури 50°С агарозу заливають на платформу Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв) обережно витягають гребінки, щоб не пошкодити при цьому карманів (лунок), платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери Заливають необхідну КІЛЬКІСТЬ розчину буфера ТБЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він покривав агарозний гель шаром товщиною 4-5мм Виставляють пробірки з продуктами ампліфікації у штатив послідовно Змішують Змкл буферу для нанесення проби та Юмкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший Електрофорез проводять у градієнті напруги ЮВ/см до того моменту, як барвник відійде від старту на 1,5-2,0см Через 20-30 хвилин електрофоретичну камеру відключити від джерела живлення і тільки після цього зняти кришку з електрофоретичної камери Вийняти платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дати рідині стекти з гелю і обережно промити агарозний гель 200 см 3 дистильованої води 2-3 рази Обережно вміщують агарозний гель на скло УФ-трансілюминатору Вмикають трансілюмінатор і аналізують отримані результати Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФвипромінювання з довжиною хвилі ЗЮнм Облік результатів У негативному контрольному зразку (К-) смужки повинні бути відсутні Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору У позитивних контрольних зразках (К+) повинна виявлятися одна смужка жовтогарячого кольору розміром 286 нуклеотидний залишок (н з ) для першого етапу ПЛР та 260н з для nestedампліфікацп Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) (286н з для першого етапу ПЛР та 260н з для nested-ампліфікаци) свідчила про відсутність вірусу хвороби Марека першого серотипу в пробі, що аналізували Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (286н з для першого етапу ПЛР та 260н з для nested-ампліфікацп), свідчить про присутність вірусу хвороби Марека першого серотипу в пробі, що аналізували Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка (286н з для першого етапу ПЛР та 260н з для nestedампліфікаци) Необхідно поставити не менш трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації Ефективність способу розкривається в прикладах Приклад 1 Для оцінки чутливості способу щодо детекци ДНК онкогенних типів ВХМ, по-перше, вивчили можливість виявлення різної КІЛЬКОСТІ специфічної ДНК Для цього використовували зразки ДНК культури ФЕК, інфікованої штамом Вогку 31/12 ВХМ з активністю 1, 10, 100, 1000 та 10000 фокусоутворюючих одиниць (ФУО)/см3 З'ясовано, що запропонований метод здатен виявляти навіть ДНК 0,1 ФУО ВХМ, що містились в ЮОмкл проби з титром ВХМ 1 ФУО/см3 Приблизно така мінімальна концентрація вірусу спостерігалась в гомогенатах патологічного матеріалу із органів, де активність ВХМ під час інфекції була найменшою Отже, чутливість методу дозволяла детектувати специфічну ДНК в органах з найменшою локалізацією ВХМ У інфікованої птиці ДНК ВХМ виявляли в фолікулах пір'я навіть в суспензії 1 1000 Приклад 2 Для визначення специфічності способу було використано 5 проб КЛІНІЧНОГО матеріалу від курей, хворих на хворобу Марека (1 група), і 5 інтактних (2 група), від яких відібрано селезінки Для контролю специфічності методу готували суспензії ХАО від курячих ембріонів, інфікованих штамами БЧ і Ла-Сота вірусу ньюкаслської хворо Комп ютерна верстка М Мацело би, ВНИИБП-У вірусу ІЛТ та вірусами інфекційної бурсальної хвороби та віспи Після першої ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг у 3 пробах КЛІНІЧНОГО матеріалу від хворих курей та в треку позитивного контрольного зразку ДНК ВХМ-І Після другої ампліфікації специфічні смуги виявлені в усіх п'яти пробах від хворих курей Проби ДНК з КЛІНІЧНОГО матеріалу від здорових курей після обох ампліфікацій не давали смуг ампліконів Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів (сумарна ДНК з суспензій ХАО від курячих ембріонів, інфікованих штамами БЧ і Ла-Сота вірусу ньюкасльської хвороби, ВНИИБП-У вірусу ІЛТ та вірусами інфекційної бурсальної хвороби і віспи) не утворювали специфічних смуг ні після першої, ні після другої ампліфікації Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів (сумарна ДНК з суспензій ХАО від курячих ембріонів, інфікованих штамами БЧ і Ла-Сота вірусу ньюкаслської хвороби, ВНИИБП-У вірусу ІЛТ та вірусами інфекційної бурсальної хвороби і віспи) також не утворювали специфічних смуг після реакції за методом, що пропонується Вперше в Україні розроблено спосіб детекцм ДНК онкогенних штамів ВХМ І серотипу на основі 286/260п н ділянки гену Meq Запропонований спосіб дозволяє виявити вірусний геном у досліджуваному матеріалі при активності вірусу в ньому до 1 ФУО/см3, що відповідає за чутливістю світовим аналогам Спосіб може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень Таблиця Спосіб індикації днк патогенних штамів вірусу хвороби марека першого серотипу № циклу Температура Час 94°С 59°С 72°С 72 94°С 59°С 72°С 72°С КІЛЬКІСТЬ ЦИК 0,7хв 1хв 1хв Юхв 0,7хв 1хв 1хв 5хв 1 2 3 (nested) 4 Підписне ЛІВ ЗО 1 25 Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького 45, м Київ МСП, 03680 Україна ДП Український інститут промислової власності вул Глазунова 1 м Київ - 42 01601 1

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

A method for the indication of dna pathogenic strains of mareks disease of the first serotype

Автори англійською

Stehnii Borys Tymofiiovych, Bilokon Viktor Stepanovych, Herilovych Anton Pavlovych

Назва патенту російською

Способ индикации днк патогенных штаммов вируса болезни марека первого серотипа

Автори російською

Стогний Борис Тимофеевич, Стегний Борис Тимофеевич, Белоконь Виктор Степанович, Герилович Антон Павлович

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/48, G09B 23/28, G01N 1/28, A61B 10/00, C12Q 1/00

Мітки: серотипу, спосіб, патогенних, індикації, марека, штамів, днк, хвороби, вірусу, першого

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/4-7889-sposib-indikaci-dnk-patogennikh-shtamiv-virusu-khvorobi-mareka-pershogo-serotipu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб індикації днк патогенних штамів вірусу хвороби марека першого серотипу</a>

Подібні патенти