Спосіб хемілюмінесцентного аналізу біологічних матеріалів

Изобретение относится к люминесцентным методам анализа и может быть использовано для диагностики различных заболеваний, являющихся следствием нарушения иммунитета человека. Раннее выявление иммунодефицитных состояний лежит в основе профилактики и лечения наиболее распространенных и тяжелых заболеваний, обусловленных, например, длительным радиационным воздействием, воздействием факторов нарушения экологического равновесия в природе и других. Ранняя диагностика зависит от чувствительности иммуноферментного анализа, предельное значение которой достигается благодаря осуществлению хемилюминесцентной детекции. Цель изобретения -диагностика различных заболеваний из одной пробы биоткани человека. Способ осуществляют следующим образом. На твердую подложку в виде ленты, слайда или плашки из прозрачного материала, например полихлорвинила, предварительно наносят все компоненты иммунохемилюминесцентной реакции, включая антитела с пероксидазной меткой в качестве катализатора, кроме биоткани исследуемого пациента. Таким образом, на твердом носителе с иммобилизованными антителами необходимых тест-систем (диагностикумов) на те или иные искомые заболевания создаются условия для проведения реакции усиленной хемилюминесценции, т. е. для пероксидазного окисления люминола в присутствии субстратов "усилителей". Одна и та же проба исследуемого пациента в виде готовой субстратной смеси с антителом, последовательно взаимодействуя с заданным рядом компонентов, нанесенных на твердый носитель диагностикумов, и пройдя все стадии иммуноферментного анализа, инициирует реакцию усиленной хемилюми-несценции. С момента нанесения (дозирования) второго компонента и при наличии иммунного взаимодействия, т. е. при наличии тестируемого заболевания, начинается регистрация свечения пробы непосредственно с подложки "на просвет". По наличию скачкообразного изменения интенсивности свечения (фиг. 1), соответствующего последовательности введения диагностикумов, судят о наличии тестируемых заболеваний. Способ может быть осуществлен посредством устройства, схема которого приведена на фиг. 2. Устройство содержит светогерметичный узел автоматической покадровой Л смены проб. В светогерметичном узле смонтирован лентопротяжный механизм 1, в который заряжена подложка в виде прозрачной непрерывной ленты 2 с нанесенными пробами 3. Лентопротяжный механизм связан с исполнительным органом 4, в качестве которого служит шаговый двигатель, соединенный с анализатором 5. Над пробой в рабочей зоне измерения закреплен дозатор 6, а снизу пробы - приемник световых сигналов 7. Дозатор подключен к анализатору 5 (схема которого изображена на фиг. 3), а приемник - к усилителюхемилюминометру 8, который также подключен к анализатору хемилюминограмм 5. Анализатор хемилюминограмм в соответствии с блок-схемой фиг. 3 содержит видеоконтрольное устройство 9, видеоинформация на которое поступает с анализатора сигналов 10. управляющие команды на который поступают с пульта управления 11, а выходная информация с видеоконтрольного устройства по команде с пульта управления поступает на блок записи 12. Устройство работает следующим образом. Прозрачная лента 2 с иммобилизованными иммунными компонентами, например, клетками антитела или так называемыми моноклональными антителами, и другими компонентами реакции (кроме второго иммунного компонента реакции), в виде проб 3 вставляется в лентопротяжной механизм. По сигналу с анализатора 5. подаваемому на исполнительный орган (шаговый двигатель) 4, лента 2 подается в зону измерения непосредственно над фотоприемником в блоке детектирования 7. затем следующий сигнал анализатора управляет дозатором 6, с помощью которого вводится последний (второй) компонент иммунохемилюминесцентной реакции (например, клетки антигена). После появления иммунного взаимодействия осуществляются общепринятые для иммуноферментного анализа операции смыва непрореагировавших клеток. В процессе работы производится термостатирование, встряхивание и другие традиционные операции. Возникающее свечение регистрируется по необходимым параметрам фотоприемником блока детектирования 7, полученные сигналы усиливаются усилителем-хемилюминометром 8. Автоматизированная обработка информации производится анализатором хемилюминограмм 5. После окончания цикла измерения по командам анализатора происходит автоматическое перемещение пленки из зоны измерения и подача следующего кадра ленты в зону измерения. По заданной программе повторяются циклы измерения и происходит дальнейшая автоматическая подача следующих проб. В качестве второго и третьего вариантов реализации устройства на чертеже фиг. 2 показаны варианты С и Π смены проб на прозрачных слайдах (С) с помощью слайдового механизма V и на прозрачных плашках (П) с помощью шаговых двигателей 1", работающие по аналогическому с (Л) принципу. Междублочные связи показаны пунктирными линиями, составные части вариантов С и Π имеют те же цифровые обозначения, что и в варианте Л, но со знаками штрих и два штриха: 1'и 1",2' и 2".......7' и 7". Стрелками показаны направления перемещения слайдов и плашки на 96 лунок. Эти варианты дают возможность пересылок пробы 3' и 3" на слайде 2' или же на плашке 2" по почте в конвертах (С) или в посылках (С и П) на любое расстояние в пределах времени сохраняемости иммобилизованных на слайде (плашке) компонентов, равного гарантийному времени сохраняемости компонентов. Пример. Определение параметров иммуноспецифичной реакции пероксидазы хрена и антител к пероксидазе. Раствор персксидазы хрена в концентрации 1 мг на 1 мл лизирующей буферной среды, дополнительно разбавленной в 10 раз, фиксировался на полистирольной подложке в количестве 10 мкл. На эту же подложку наносился раствор 0,65 мл люминола в количестве 10 мкл. Моноклональные антитела на перокси-дазу в количестве 20 мкл разбавлялись в 180 мкл среды и добавлялись на твердую подложку к ранее нанесенным компонентам в количестве 10 мкл. Развитие реакции схематически показано на фиг. 1 в координатах время txA - интенсивность хемилюминесценции NХА. Исходный уровень свечения в системе без моноююнальных антител составлял 60 и. С-1 на уровне фона 20 и с-1. Максимальная амплитуда вспышки иммунохемилюминесцентной реакции при добавлении антител составила 340 и. С-1 . Система работала устойчиво и реакция была воспроизведена с точностью ≤ 5% через 20 дней после первоначального нанесения исходных компонентов (без антитела).