Спосіб діагностики мутації 657del5 гена nbsl

Спосіб діагностики мутації 657del5 гена nbsl, що включає виділення ДНК, отримання та амплі 3 19773 4 нтів екзону 6 відомої послідовності ДНК та дослі657del5 гена nbsl (лунка 4). Перед зразками ДНК джуваної ДНК. у співвідношенні 3:1. Кінцеву суміш обов'язково наносили маркери молекулярної ваги. покривають мінеральним маслом та переносять у У лунки 1 та 2 наносять по 10мкл зразка, у лунки 3 нагрітий до 95°С термостат. Денатурація зразків та 4 наносять по 15мкл зразка. Електрофоретичне триває 5 хвилин, після чого реакційну суміш для розділення проводили у 10% поліакриламідному формування гетеродуплексних фрагментів ДНК гелі (при співвідношенні акриламіду до бісакриланегайно переносять у нагрітий до 55°С термостат міду 29:1) з використанням трис-боратного буферу та інкубують протягом 45 хвилин. Для того, щоб при напрузі 200V/150mA протягом 4 годин. Після уникнути негативної дії температури зовнішнього електрофоретичного розділення гель фарбується середовища при перенесенні з термостату в террозчином бромистого етидію (концентрація останмостат, використовують термостат, температура нього складає 1мг/л) та оцінювалися результати. якого автоматично регулюється мікрокомп'ютером. Отримані результати свідчать про те, що: Гібридизацію проводять протягом 1 години, після 1. Ампліфіковані фрагменти екзону 6 гена nbsl чого суміш охолоджують та зберігають при 4°С. зразка N22 характеризувалися збільшеною електЕлектрофоретичне розділення фрагментів ДНК рофоретичною активністю у порівнянні з контропроводять у 10% поліакриламідному гелі, протяльним зразком, що передбачає присутність делеції гом 4 годин. в екзоні 6 гена nbsl в зразку N22; Приклад 1. 2. Виявлено наявність гетеродуплексних фраПавло С., 12.07.1996 р.н., народився та посгментів при взаємодії ампліфікованих фрагментів тійно проживає у с. Штунь, Волинської області. досліджуваного зразка N22 та попередньо отриЗвернувся у 2004 році до Львівського медикоманих фрагментів ДНК екзону 6 гена nbsl що не генетичного центру. При обстеженні була виявлемістять мутації гена nbsl. Це підтверджує припуна мікроцефалія, часті бронхо-легеневі захворющення 1; вання в анамнезі. На підставі первинного клінічно3. Виявлено відсутність гетеродуплексних го діагнозу "синдром Ніймегена" була проведена фрагментів при взаємодії ампліфікованих фрагмемолекулярно-генетична діагностика мутацій екзону нтів досліджуваного зразка N22 та попередньо 6 гена nbsl згідно пропонованого процесу. отриманих фрагментів ДНК екзону 6 гена nbsl що З 5мл венозної крові пацієнта класичним фемістять мутацію 657del5 гена nbsl, що підтверджує нольним методом виділено ДНК, яка отримала код попередні пп.1 та 2 про наявність мутацій екзону 6 N22. Фрагменти екзону 6 гена nbsl отримували гена nbsl у досліджуваному зразку N22. відомим методом ампліфікації з використанням Отже, в результаті проведення молекулярноолігонуклеотидних праймерів, комплементарних генетичної діагностики виявлено наявність мутації екзону 6; ампліфіковані фрагменти очищали згідно 657del5 екзону 6 гена nbsl в зразку N22. загальноприйнятих методів, розчинивши фрагменПриклад 2. ти у буфері, що містить 10mM TRIS-HCl, 0.1mM Євген К., 23.04.1990 р.н., народився та постійEDTA. Концентрацію фрагментів ДНК вимірювали но проживає у м Симферополі. Звернувся у 2004 оптичним методом: кінцева концентрація фрагмероці до хірурга в зв'язку зі збільшенням шийнонтів у буфері складала 10нг/мкл. До 15мкл попелатеральних вузлів. Діагноз: Негоджкінська Тредньо втриманих фрагментів екзону 6 відомої клітинна лімфобластна лімфома III ступеня з урапослідовності ДНК додавали 5 мкл суміші після женням лімфовузлів шийно-латеральної області шпліфікації екзону 6 гена nbsl, яка містила амплізліва, І терапевтична група. Супутній діагноз: синфіковані фрагменти досліджуваної ДНК у яіввіддром Ніймегена. ношенні 3:1. Кінцеву суміш покривали мінеральНа підставі супутнього діагнозу "синдром Нійним маслом та переносили у нагрітий до 55°С мегена" 14.02.2006 р. була проведена молекуляртермостат на 5 хвилин, після чого реакційну суміш но-генетична діагностика мутацій екзону 6 гена переносили у нагрітий до 55°С гермостат та інкуnbsl згідно пропонованого процесу. бують протягом 45 хвилин. Гібридизацію провоЗ 5мл венозної крові пацієнта класичним федять протягом 1 години, після чого суміш охолонольним методом виділено ДНК, яка отримала код джують та зберігають при 4°С. N75. Фрагменти екзону 6 гена nbsl отримували, як Після реакції формування гетеродуплексних описано вище, відомим методом ампліфікації з фрагментів ДНК проводили шектрофоретичне ровикористанням олігонуклеотидних праймерів, комзділення фрагментів ДНК у 10% поліакриламідноплементарних екзону 6; ампліфіковані фрагменти му гелі, при цьому іанесення досліджуваних зразочищали згідно загальноприйнятих методів, розків для електрофоретичного розділення проводять чинивши фрагменти у буфері, що містить 10mM згідно наступного порядку: контрольний зразок TRIS-HC1, 0.1mM EDTA. Після реакції формування ДНК, що не містить мутацій екзону 6 (лунка 1); гетеродуплексних фрагментів ДНК проводили еледосліджуваний зразок ампліфікованого фрагменту ктрофоретичне розділення фрагментів ДНК у 10% ДНК (лунка 2); продукт реакції формування гетеполіакриламідному гелі. родуплексів між досліджуваним зразком ампліфіА. Ампліфіковані фрагменти екзону 6 гена nbsl кованого фрагменту ДНК та попередньо отримазразка N75 характеризувалися однаковою електними фрагментами ДНК відомої послідовності, що рофоретичною активністю у порівнянні з контроне несуть мутації 657del5 гена nbsl (лунка 3); прольним зразком, що передбачало відсутність мутадукт реакції формування гетеродуплексів між досцій в екзоні 6 гена nbsl в зразку N75. ліджуваним зразком ампліфікованого фрагменту Б. Виявлено відсутність гетеродуплексних ДНК та попередньо отриманими фрагментами фрагментів при взаємодії ампліфікованих фрагмеДНК відомої послідовності, що містять мутацію нтів досліджуваного зразка N75 та попередньо 5 19773 6 отриманих фрагментів ДНК екзону 6 гена nbsl що тики при зниженні тривалості процесу та зменне містять мутації гена nbsl. Це підтверджує пришенні матеріальних видатків. пущення пункту А. Джерела інормації: Отже, в результаті проведення молекулярно1. Patrick J. Concannon; Christine S. Vissinga; генетичної діагностики не було виявлено мутацій Karen M. Cerosaletti; Raymonda Varon-Mateeva; екзону 6 гена nbsl в зразку N75. Karl Sperling; Andre Wiesmann da Silva Reis. A Запропонований спосіб застосований при 96 gene associated with Nijmegen breakage syndrome, дослідженнях. При цьому, в 34 випадках вдалося it's gene product and methods for their use діагностувати наявність мутації 657del5, а в 62 International Application № WO 99/55716; Filed April випадках вона була відсутня. В той час, як при 27, 1998; Date of Patent: November 4, 1999. використанні найближчого аналога однозначний 2. I.B. Resnick, I. Kondratenko, О. Togoev, N. діагноз (без продовження процесу із застосуванVasserman, I. Shagina, О. Evgrafov, S. Tverskaya, K. ням методу секвенування ДНК) не вдалося встаM. Cerosaletti, R. A. Gatti, P. Concannon. Nijmegen новити у жодному випадку. breakage syndrome: clinical characteristics and Таким чином, використання запропонованого mutation analysis in eight unrelated Russian families способу дозволяє збільшити ефективність діагнос// J. Pediatr. - 2002. - Vol. 140. - p. 355-361. Комп’ютерна верстка М. Мацело Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601