Мутації enos, що є корисними для генотерапії та терапевтичного скринінгу

1. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує мутантну форму поліпептиду синтетази оксиду азоту (NOS) дикого типу, вибрану з групи, що складається з суттєво активного поліпептиду NOS, поліпептиду NOS з підвищеною швидкістю вироб 2 (19) 1 3 76939 4 19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що 6. Поліпептид, який кодується виділеною молекулою нуклеїнової кислоти за будь-яким з пунктів експресія трансгена обмежується шлуночково1-5. серцевими міоцитами. 20. Спосіб за будь-яким з пп. 9-19, який відрізня7. Мутантна форма поліпептиду NOS дикого типу, ється тим, що трансген кодується вектором дефевибрана з групи, яка складається з суттєво активного поліпептиду NOS, поліпептиду NOS з підвиктивної реплікації. 21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що щеною швидкістю виробництва NO та поліпептиду NOS з підвищеною активністю редуктази, причому вектор дефективної реплікації - це аденовірус. 22. Спосіб за будь-яким з пп. 9-19, який відрізнязазначений поліпептид NOS, крім того, містить ється тим, що трансген трансфектують у клітину in заміну амінокислотного залишку, який відповідає S/T в мотиві консенсус-послідовності RXRXXS/T vitro. 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що поліпептиду NOS дикого типу, а заміщеним амінокислотним залишком є залишок 1179 бичачої пацієнтові вводять трансфектовані клітини. 24. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, щотeNOS, залишок 1177 людської eNOS, залишок 1412 nNOS щурів або залишок 1415 людської рансген вводять внутрішньосудинно, внутрішньоnNOS. м'язово, крізь шкіру, інтраперитонеально або внут8. Мутантна форма поліпептиду NOS дикого типу рішньоартеріально. за п. 7, яка відрізняється тим, що заміщена амі25. Трансгенна тварина, окрім людини, яка екснокислота заміщена залишком аспарагінової киспресує поліпептид за п. 7. лоти або глутамінової кислоти, а сама вона є сут26. Спосіб ідентифікації агента, який модулює Aktтєво активним поліпептидом eNOS. регульовану активність NOS, при якому здійсню9. Спосіб стимулювання розвитку коронарних коють наступні етапи: латеральних судин у пацієнта, при якому здійсню(а) впливання на клітину, що експресує NOS, агенють етап введення трансгена, що кодує поліпептом; та тид за п. 7, так, що це сприяє розвитку коронарних (б) визначення Akt-регульованої активності NOS, колатеральних судин. ідентифікуючи цим агент, який модулює Akt10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що регульовану активність NOS. 27. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що на трансген експресується з шлуночкового міоцитспецифічного промотору, промотору, специфічноетапі (б) здійснюють визначення стану фосфориго для клітин гладкого м'яза, або промотору, спелування NOS на амінокислотному залишку, що цифічного для ендотеліальних клітин. відповідає залишку 1179 бичачої eNOS, залишку 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що 1177 людської eNOS, залишку 1412 nNOS щурів шлуночковий міоцит-специфічний промотор має або залишку 1415 людської nNOS. 28. Спосіб за п. 27, який відрізняється тим, що послідовності промотору легкого ланцюга-2 шлуночкового міозину або промотору важкого ланцюга NOS активують агентом. 29. Спосіб за п. 28, який відрізняється тим, що міозину. 12. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що агент імітує Akt-опосередковане фосфорилування промотор, специфічний для ендотеліальних кліeNOS. 30. Спосіб за п. 29, який відрізняється тим, що тин, - це промотор Tie-2, промотор ендотеліну або промотор eNOS. агент інгібує дефосфорилування амінокислотного 13. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що залишку, що відповідає залишку 1179 бичачої промотор клітин гладкого м'яза - це промотор eNOS, залишку 1177 людської eNOS, залишку SM22 або промотор альфа-актину SM. 1412 nNOS щурів або залишку 1415 nNOS людини. 14. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що 31. Спосіб за п. 26, який відрізняється тим, що на трансген вводять внутрішньосудинно, внутрішньоетапі (б) здійснюють вимірювання виробництва м'язово, крізь шкіру, інтраперитонеально або внутNO. 32. Спосіб за п. 31, який відрізняється тим, що рішньоартеріально. 15. Спосіб стимулювання розвитку судин у пацієнздійснюють виявлення NO шляхом вимірювання та, який має хворобу периферійної судинної недоконцентрацій нітриту або конверсією 3H-L-аргініну статності, при якому здійснюють етап доставки до 3H-L-цитруліну. трансгена, що кодує поліпептид за п. 7, до пери33. Спосіб in vitro ідентифікування агента, який ферійної судинної системи пацієнта так, що це модулює Akt-регульовану активність eNOS, при сприяє розвитку периферійних судин. якому здійснюють наступні етапи: 16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що (а) впливання агентом на біпок або пептид Akt та трансген вводять внутрішньосудинно, внутрішньоNOS; та м'язово, крізь шкіру, інтраперитонеально або внут(б) вимірювання активності NOS. 34. Спосіб за п. 33, який відрізняється тим, що рішньоартеріально. 17. Спосіб лікування ішемії міокарда, при якому активність NOS вимірюють шляхом визначення здійснюють етап доставки трансгена, що кодує стану Akt-залежного фосфорилування NOS. 35. Спосіб за п. 34, який відрізняється тим, що на поліпептид за п. 7, до міокарда так, що це сприяє лікуванню ішемії міокарда. етапі (б) активність NOS - це активність редуктази. 18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що 36. Спосіб за п. 34, який відрізняється тим, що на експресія трансгена обмежується серцевими міоетапі (б) активність NOS - це виробництво NO цитами. NOS. 37. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує мутантну форму поліпептиду NOS дикого 5 76939 6 типу, вибрана з групи, що складається з бичачої 40. Мутантна форма поліпептиду NOS дикого типу eNOS, яка містить заміщений амінокислотний заза п. 39, де заміщений амінокислотний залишок лишок, який відповідає залишку 1179, людської це аланін. eNOS, яка містить заміщений залишок, який відпо41. Спосіб лікування серцево-судинної хвороби у відає залишку 1177, nNOS щурів, яка містить запацієнта, при якому здійснюють етап введення міщений залишок, який відповідає залишку 1412, пацієнтові трансгена, що кодує поліпептид за п. 7. 42. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що та людської nNOS, що містить заміщений залишок, який відповідає залишку 1415, де заміщений амісерцево-судинна хвороба вибрана з групи, що нокислотний залишок містить не негативно заряскладається з серцевої недостатності, інфаркту джену R-ґрупу. міокарда, рестенозу, стенозу після пластичної 38. Виділена молекула нуклеїнової кислоти за операції на судинах, стент стенозу та недостатноп. 37, де заміщений амінокислотний залишок - це сті обхідного судинного шунта. 43. Спосіб за п. 41, який відрізняється тим, що аланін. 39. Мутантна форма поліпептиду NOS дикого типу, трансген вводять внутрішньосудинно, внутрішньовибрана з групи, яка складається з бичачої eNOS, м'язово, крізь шкіру, інтраперитонеально або внутяка містить заміщений амінокислотний залишок, рішньоартеріально. що відповідає залишку 1179, людської eNOS, яка 44. Спосіб лікування еректильної дисфункції у памістить заміщений залишок, що відповідає залишцієнта, при якому здійснюють етап введення паціку 1177, nNOS щурів, яка містить заміщений залиєнтові трансгена, що кодує поліпептид за п. 7. 45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що шок, що відповідає залишку 1412, та людської nNOS, яка містить заміщений залишок, що відпотрансген вводять внутрішньосудинно, внутрішньовідає залишку 1415. де заміщений амінокислотний м'язово, крізь шкіру, інтраперитонеально або внутзалишок містить не негативно заряджену R-групу. рішньоартеріально. Ця заявка заявляє право пріоритету попередньої заявки США №60/129,550, яка була подана 16 квітня 1999 року та яку включено шляхом посилання у цей опис у її повному обсязі. Цей винахід виник частково з дослідження, що фінансувалося наступними федеральними грантами: НL 57665 та НІ 61371. Цей винахід стосується нових варіантів або мутантів NOS, що містять структурні зміни у ділянці Аkt-залежного фосфорилування. Змінені білки або пептиди NOS та їхні кодувальні молекули нуклеїнової кислоти є корисними як агенти генотерапії для лікування хвороб, до яких належать рестеноз після пластичної операції на судинах, гіпертензія, атеросклероз, серцева недостатність, діабет та хвороби з недостатнім розвитком кровоносних судин. Атеросклероз та судинний тромбоз є головною причиною захворюваності та смертності, вони спричиняють хворобу коронарної артерії, інфаркт міокарда та удар. Атеросклероз розпочинається зі зміни в ендотелії, що оточує кровоносні судини. Зміна в ендотелії може, зрештою, стати причиною розвитку патологічного пошкодження ендотелію, викликаного, частково, поглинанням окисленого ліпопротеїму низької густини (LDL) холестерину. Розрив такого пошкодження може стати причиною тромбозу та закупорки кровоносної судини. У випадку з коронарною артерією розрив складного пошкодження може прискорювати інфаркт міокарда, тоді як у випадку з сонною артерією, наслідком може стати удар. Під час атеросклеротичної ішемічної хвороби серця ендотеліальна дисфункція може зменшити виробництво судинорозширювальних речовин, таких як оксид азоту. Ішемія міокарда виникає, коли перешкоджується авторегуляторне розширення судин, або шляхом обмежуючого кровотік стенозу коронарної артерії, або шляхом ендотеліальної дисфункції. В обох випадках артеріальний кровотік може подалі не зростати пропорційно до зростаючих потреб у кисні. В інших ситуаціях ішемія міокарда може виникати, коли потреби у кисні є постійними, але існує первинне зменшення коронарного кровотоку, опосередковане спазмом коронарної артерії, швидким розвитком долішньої атеросклеротичної бляшки, що спричиняє зменшення розміру просвіту коронарної артерії, та/або переривчастою мікросудинною закупоркою агрегатами тромбоцитів. Пластичні операції на судинах із застосуванням балона звичайно застосовують для відкриття проходу кровоносної судини, звуженої бляшкою. Незважаючи на те, що пластичні операції на судинах із застосуванням балона є успішними у високому відсотку випадків відкриття проходу судини, вони часто оголюють ендотелій та пошкоджують судину у цьому процесі. Таке пошкодження спричиняє міграцію та проліферацію клітин судинних гладких м'язів кровоносної судини у ділянку травмування з наступним утворенням пошкодження, відомого як гіперплазія внутрішньої оболонки м'язів кровоносних судин або рестеноз. Це нове пошкодження стає причиною рецидиву симптомів через три-шість місяців після пластичної операції на судинах у значної частини пацієнтів. 7 76939 8 Під час атеросклерозу, тромбозу та рестенозу eNOS людини, та активувати фермент, що зумовтрапляється також втрата нормальної судинної лює виробництво NO. Мутантна eNOS (S1179А функції, так що судини мають тенденцію звужуваабо S1177А) є стійкою до Аkt-фосфорилування та тися, а не розширюватися. Надмірне звуження активації, проте мутантна eNOS (311790 та кровоносних судин стає причиною подальшого 31177Р) або (S1179Е та S1177Е) є суттєво активзвуження просвіту судин, що обмежує кровотік. ною. Крім того, застосування Аkt, активованого Усе це може спричиняти такі симптоми, як стеноопосередкованим аденовірусом переносом генів, кардія (якщо залучена серцева артерія) або тимпідвищує виділення базального оксиду азоту з часова церебральна ішемія (тобто "невеликий ендотеліальних клітин, а неактивна Аkt послаблює удар", якщо залучена судина головного мозку). Ця виробництво NO, стимульоване VEGF. Отже, аномальна судинна функція (надмірне звуження eNOS - це щойно описаний субстрат Аkt, що зв'ясудин або неадекватне розширення судин) винизує сигнальну трансдукцію через Аkt для виділенкає в інших хворобах, які перелічено далі. Гіпертеня газоподібного вторинного месенджера, NO. Цей нзія (високий кров'яний тиск) спричиняється надвинахід також засновуються, частково, на тому мірним звуженням судин, а також ущільненням відкритті, що мутантна eNOS (S1179D) демонструє стінки судини, особливо у дрібних судинах кровоопідвищення швидкості виробництва NO та підвибігу. Цей процес може шкідливо впливати на судищення активності редуктази. ни легенів, спричиняючи також легеневу гіпертенЦей винахід включає поліпептиди або білки зію. До інших розладів, пов'язаних з надмірним NOS та їх кодувальні виділені молекули нуклеїнозвуженням судин або неадекватним розширенням вої кислоти де поліпептид або білок NOS містить судин, належать атеросклероз трансплантата, заміщений амінокислотний залишок, що відповідає застійна серцева недостатність, токсикоз вагітних, залишкові 1179 бичачої eNOS, залишкові 1177 феномен Рейно, стенокардія Принцметала (королюдської eNOS, залишкові 1412 nNOS щурів, занарний вазоспазм), церебральний вазоспазм, гелишкові 1415 людської nNOS. Переважні заміщенмолітична уремія та імпотенція. ня включають нуклеїнової кислоти з негативно Речовина, яка виділяється ендотелієм та яка зарядженими R-групами, до яких належать аспаспочатку визначалася як "розслаблювальний факрагінова кислота та глютамінова кислота. тор, що походить з ендотелію" (ЕDRF), відіграє Цей винахід також включає поліпептиди або важливу роль в інгібуванні цих патологічних пробілки NOS та їх кодувальні виділені молекули нукцесів. Зараз відомо, що розслаблювальний факлеїнової кислоти, де поліпептид або білок NOS тор, що походить з ендотелію (ЕDRF), є оксидом містить заміщений амінокислотний залишок, що азоту (NO). Оксид азоту відіграє багато ролей у відповідає залишкові 1179 бичачої eNOS, залишфізіології людини, в тому числі релаксацію судинкові 1177 людської eNOS, залишкові 1412 nNOS них гладких м'язів, інгібування агрегації тромбоцищурів або залишкові 1415 людської nNOS. Перетів, інгібування мітогенезу, проліферацію судинних важні заміщення включають нуклеїнової кислоти з гладких м'язів та прилипання лейкоцитів. Оскільки не-негативно зарядженими R-групами, такі як алаоксид азоту є найсильнішим ендогенним вазодинін. лататором та оскільки він здебільшого зумовлює Цим винаходом пропонуються способи стимувазодилатацію у канальних артеріях, що є наслідлювання колатерального розвитку судин при ішеком фізичного навантаження, активація синтезу мічних хворобах з недостатнім ендогенним розвиоксиду азоту може також підвищити фізичні здібтком кровоносних судин, особливо при хворобі ності здорових людей, а також людей з судинною периферійних судин та/або ішемії міокарда у паціхворобою. єнта, при цьому способи включають введення Ендотеліальна синтаза оксиду азоту (еNОS) трансгена, що кодує поліпептид NOS винаходу або це ізоформа синтази оксиду азоту (NOS), що відполіпептид Аkt. повідає за підтримку системного кров'яного тиску, Винахід далі включає трансгенну тварину не судинну реконструкцію та розвиток кровоносних людського походження, що експресує поліпептид судин [Shesely еt аl., 1996; Huang еt аl., 1995; Rudic NOS винаходу. еі аl., 1998; Мurohara еt аl., 1998]. Оскільки недоНарешті, винахід включає способи ідентифікастатнє виробництво NO ендотелієм є ранньою ції агента, який модулює регульовану Аkt активстійкою рисою атеросклерозу та судинного пошконість NOS, при цьому способи взагалі включають дження, то було доведено, що еNOS є приваблиетапи: а) обробки агентом очищеної NOS, перевавим об'єктом для судинної генотерапії. Незважаюжно eNOS або nNOS, або клітини, що експресує чи на те, що регулювання активації eNOS NOS, переважно eNOS або nNOS, та Аkt; та б) залишається здебільшого невідомим, проте відовимірювання Аkt-регульованої активності NOS, мо, що eNOS фосфорилується у відповідь на різні переважно eNOS або nNOS. форми клітинної стимуляції [МісhеІ еt аl., 1993; Фігури 1А-1В. Аkt природного типу, проте кінаGarcia-Cardena еі аl., 1996; Соrsоn еt аl., 1996], зно не пасивна Аkt, підвищує виділення NO з кліпроте роль фосфорилування в регуляції виробнитин, що експресують мембрано-зв'язану eNOS. На цтва оксиду азоту (NO) та кіназ(и), що зумовлюФіг.1А -клітини СОS трансфектували плазмідами ють(є) це, раніше не пояснювалася. для eNOS, у відсутності або присутності Аkt або Цей винахід є наслідком, частково, нового відкіназно пасивної Аkt (К179М), та визначили виробкриття того, що серин/треонін протеїнкіназа, Аkt ництво NO (аналізували як NO2-) шляхом хемілю(протеїнкіназа В), може безпосередньо фосфоримінесценції. На Фіг.1В - клітини СOS трансфектулувати eNOS на залишку серину, що відповідає вали різними плазмідами NOS, як описано вище. залишку 1179 у eNOS бика або залишку 1177 у На обох Фіг.1А та Фіг.1В значення для виробницт 9 76939 10 ва NO2- відняли від рівнів, отриманих з клітин, траVЕGF (40нг/мл) протягом 30 хвилин та визначили кількість виділеного NO2- шляхом хемілюмінесценнсфектованих лише кДНК -галактозидази. Вставції. Данні представлено як виділення NO2-, стимука демонструє експресію білків у загальних клітинльоване \/ЕGF, після віднімання базальних рівнів. них лізатах. Данні - це середнє ±SЕМ, n=3-7 Данні - це середнє значення ±SЕМ, n=4; * вказує експериментів, * позначає р