Спосіб визначення біологічної сумісності тканин

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, молекулярной иммунологии и может быть использовано в трансфузиологии и трансплантологии. В общепатологическом плане биологическая несовместимость является реакцией защиты, направленной на сохранение и поддержание постоянства, устойчивости, состава и свойств каждого отдельного целостного организма, а иммунологические проявления этих реакций защиты обусловлены взаимодействием антигенов с антителами [БМЭ. 3-е изд. Т.6,1977, с. 1451]. Профилактика посттрансфузионных осложнений, связанных с антигенной несовместимостью крови донора и реципиента, основана на методах иммунологического подбора [Шебалин В.Н., Серова Л.Д. Клиническая иммуногематология. Л., 1988, с. 215]. Известен способ определения биологической совместимости, например, крови донора и реципиента по группам крови систем ABO, MNSs, P, Rh, Lutheran, Lewis, Kelt, Duffy, Kidd, Diego, II, Auberger, Xg, Dombrock, а также лейкоцитарных групп по системе HLA и групп сывороточных белков [БМЭ. Изд. 3-е. Т. 6. 1977, с. 490]. За прототип принят способ определения биологической совместимости тканей -Проба на совместимость [Руководство по применению крови и кровезаменителей / Под ред. А.Н. Филатова. Л., Медицина, 1973, с. 82]. Согласно этого способа, к двум каплям сыворотки крови реципиента прибавляется в 5-8 раз меньшая капля эритроцитов донора, капли перемешиваются и выжидается агглютинация (склеивание эритроцитов), в течение 5 минут. При появлении агглютинации, которая учитывается визуально, проба считается положительной, а кровь донора и реципиента являются биологически несовместимыми по системе АВО. Если же реакция окажется отрицательной, то сразу приступают к проведению пробы на водяной бане. Для этого на чашку Петри наносятся 2 большие капли сыворотки реципиента и к ним прибавляется полкапли крови донора. Капли перемешиваются, и чашка помещается на водяную баню (46°С), на 10 минут, затем просматривается результат, который учитывается визуально, по наличию агглютинации эритроцитов. Если агглютинация отсутствует, следовательно, кровь совместима и по системе Rh. Однако известные способы и способ-прототип имеют следующие недостатхи: - они многоэтапны и не позволяют оценить в целом, интегрально биологическую совместимость, а оценивают ее по каждому антигену, раздельно, например, совместимость только по резус-фактору при помощи пробы на совместимость или групповую совместимость по системе АВО; - не исключают ложноположительные и ложноотрицательные реакции; - не всегда возможна идентификация специфичности реакций, т.к. явление агглютинации, преципитации (склеивание белковых молекул) и гемолиза (разрушение клеток) может носить и неспецифический характер; - оценка результатов основана на субъективном, визуальном методе его анализа, например, по наличию или отсутствию агглютинации или преципитации, что может привести к ошибке учета, например, в случае появления микропреципитатов, или микро-агглютинатов, которые невозможно учесть визуально; - невозможность визуального учета реакции при определении биологической совместимости белков плазмы; - трудоемкость исследований, например, для определения групп крови системы АВО требуется идентифицировать 10 антигенов, а для системы HLA - число возможных комбинаций антигенов в первом сублокусе составляет 190, а во втором - 210; - использование сложных биотехнологий при изготовлении тест-систем для определения биологической совместимости, например, по системам АВО, HLA и пр.; - отсутствие в лечебных учреждениях достаточного набора необходимых тест-систем, из-за чего подбор крови осуществляется только с учетом совместимости по антигенам системы АВО и системы Rh, поэтому данные литературы свидетельствуют, что у 60% больных при таком подборе повторные переливания крови вызывают посттрансфузи-онные негемолитические реакции. Все это явилось основанием для разработки предлагаемого нами способа определения биологической совместимости тканей. В основу изобретения поставлена задача усовершенствования способа определения биологической совместимости тканей, в котором, за счет выявления свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений, обеспечивается идентификация специфичности реакции антиген-антитело при определении биологической совместимости, что позволит упростить способ и- повысить его чувствительность и точность. Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе определения биологической совместимости тканей, путем соединения in vitro биологического материала донора с биологическим материалом реципиента, согласно изобретению, полученную смесь депротеинизируют, затем определяют свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений, по появлению или отсутствию которых судят о биологической несовместимости или совместимости. Определение содержания свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений проводили методом амперометрического титрования [Kolthoff I.M. Harris. W.E. Ampermetric Tltration of Mercaptans with silver nitrate Using the Rotating Platinum Electrode.- Ind. Eng. Chem. Anal. ed. 1946,18, 3, p. 161-162]. Сущность способа заключается в том, что In vitro соединяют биологический материал донора, а именно, сыворотку крови с биологическим материалом реципиента, а именно, с сывороткой крови в соотношении 1:10, с дальнейшей их депротеинизацией, т.е. осаждением белков соединенного таким образом биологического материала. Затем осуществляют определение свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений указанным выше методом. В случае появления свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений, судят о биологической несовместимости тканей донора и реципиента. Свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений являются молекулярным маркером, при помощи которого возможна интегральная оценка биологической совместимости по антигенам, находящимся в исследуемых, соединенных in vitro биологического материала донора и биологического материала реципиента. При повреждении белковых молекул, обусловленном реакцией антиген-антитело, от соединения in vitro биологически несовместимых тканей донора и реципиента, нами впервые обнаружен феномен появления свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений в де-протеинизированной смеси биологического материала донора и реципиента. В случае биологической совместимости тканей донора и реципиента, свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений в депротеинизированной смеси биологического материала донора и реципиента не определяются, Кроме того, при раздельном определении этого показателя в депротеинизированной сыворотке крови донора и реципиента, они также не определяются. Заявляемый нами способ является в определенном смысле общим для идентификации биологической совместимости, т.к. появление или отсутствие указанного выше молекулярного маркера позволяет интегрально оценить совместимость по антигенам, находящимся в исследуемом соединенном in vitro биологическом материале донора и реципиента. Кроме того, заявляемый способ позволяет объективно, по наличию или отсутствию указанного выше молекулярного маркера, учитывать специфичность реакций антиген-антитело при определении биологической совместимости, что делает его высокоинформативным, т.к. позволяет, после соединения биологического материала донора с биологическим материалом реципиента определять свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений в депротеинизированном биологическом материале, по наличию или отсутствию которых судят о биологической совместимости, Известен способ определения тиоловых групп небелковой фракции при патологических состояниях, в эритроцитах, лейкоцитах и других клетках, но не в сыворотке крови. Определение свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений в депротеинизированном биологическом материале донора, соединенного in vitro с биологическим материалом реципиента, в патентной и научной литературе не описано. Предлагаемый нами способ осуществляется следующим образом: у донора и реципиента, с соблюдением правил асептики, из кубитальной вены производят забор крови в количестве 5 мл в сухую стерильную пробирку. Кровь доставляют в лабораторное отделение, обводят сухой стерильной палочкой, ставят в штатив в наклонное положение, затем центрифугируют (3000 д, 15 мин, при 20°С). В дальнейшем, согласно требованиям "Руководства по применению крови и кровезаменителей"/ Под ред. А.Н. Филатова. Л., Медицина. 1973, с. 48-82 проводят определение групп крови у донора и у реципиента по системе АВО и системе Rh, а также, согласно этого же Руководства определяют биологическую совместимость крови донора и реципиента способом-прототипом Дополнительно сыворотку крови донора и реципиента в количестве 1,0 мл отбирают для определения биологической совместимости по предлагаемому нами способу. В последующем, согласно предлагаемого нами способа, сыворотку крови донора и реципиента соединяют In vitro в соотношении 1:10, после чего соединенный таким образом биологический материал, ставят в термостат при 37°С на 5 минут. Определение свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений в соединенном in vitro биологическом материале донора и реципиента проводят однократно после их пятиминутного термо-статирования. Для этого, указанный биологический материал, отбирают в количестве 0,5 мл и подвергают депротеинизации, после чего центрифугируют при 1000 д, 10 мин. В дальнейшем, согласно предлагаемого нами способа, в 1 мл депротеиниэированного биологического материала определяют свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений по указанному выше методу, содержание которых выражают в мкмоль/л По появлению или отсутствию в соединенном In vitro биологическом материале донора и реципиента свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений судят о биологической несовместимости или совместимости ткани. Получены следующие результаты. Установлена четкая связь между биологической совместимостью или несовместимостью тканей и отсутствием или наличием свободных кислотоустойчивы> тиоловых групп низкомолекулярных сое динений, которые не выявляются или вы являются в соединенном In vitro биологическом материале донора и реципиента. Причем, если в соединенном in I vitro биологическом материале донора с биологическим материалом реципиента, появляются свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений, судят о биологической несовместимости тканей донора и реципиента. Если же в соединенном In vitro биологическом материале донора с биологическим материалом реципиента, не появляются свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений, судят о биологической совместимости тканей донора и реципиента. Нами обследовано 294 образца крови, из которых были составлены 147 пар образцов крови, каждая из которых нами условно принята как пара "донор-реципиент". Согласно требований указанного выше Руководства, проводилось определение групп крови по системе АВО и системе Rh, а также, согласно этого же Руководства определялась способом-прототипом биологическая совместимость указанных образцов крови. Для доказательства поставленной цели нами смоделирована биологическая несовместимость тканей путем соединения in vitro двух образцов биологического материала с заранее известной их биологической несовместимостью (контроль и подтверждение несовместимости проводился по системам групп крови АВО и Rh, а также по способу-прототипу). Кроме того, эти образцы биологического материала подвергались исследованию на биологическую совместимость предлагаемым нами способом. Для доказательства поставленной цели нами также смоделирована биологическая совместимость тканей путем соединения In vitro двух образцов биологического материала с заранее известной их биологической совместимостью (контроль и подтверждение совместимости проводился по системам групп крови АВО и Rh, а также по способу-прототипу). Кроме того, эти образцы биологического материала подвергались исследованию на биологическую совместимость предлагаемым нами способом. Из 147 пар образцов крови, условно принятых как пара "донор-реципиент" были выделены четыре группы: I группа - 32 пары (из 147) "донор-реципиент", у которых группы крови при определении по системе АВО не совпадали, а по системе Rh - совпадали, и при определении способом-прототипом биологический материал "донора" и "реципиента" был не совместим; II группа - 8 пар (из 147) "донор-реципиент", у которых группы крови при определении по системе АВО совпадали, а по системе Rh - не совпадали, и при определении способом-прототипом биологический материал "донора" и "реципиента" был не совместим; III группа - 5 пар (из 147) "донор-реципиент", у которых группы крови при определении по системам АВО и Rh не совпадали, и при определении способом-прототипом биологический материал "донора" и "реципиента" был не совместим; IV группа (группа сравнения) - 102 пары (из 147) "донор-реципиент", у которых группы крови при определении по системам АВО и Rh совпадали, и при определении способом-прототипом биологический материал "донора" и "реципиента был совместим. Следует отметить, что нами предварительно определялось наличие свободных кислотоустойчивых тиоловых групп низкомолекулярных соединений в депротеинизированной сыворотке крови раздельно, в каждом из 254 образцов сыворотки крови, которые не были обнаружены ни в одном из обследованных образцов до их совмещения. При определении биологической совместимости предлагаемым нами способом в указанных выше I, II, III и IV группах, получены следующие результаты: В I, II и III группах, при определении биологической совместимости тканей предлагаемым нами способом у 45 пар "донор-реципиент", т.е. у всех без исключения, после совмещения биологического материала "донора" с биологическим материалом "реципиента", обнаружены свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений в депротеинизированной смеси сывороток в количестве от 18 до 65 мкмоль/л. Такие результаты подтверждают, что заявляемый нами способ определяет биологическую несовместимость независимо от состава групповых антигенов биологического материала "донора" и "реципиента", по которым этот биологический материал несовместим. В IV группе, при определении биологической совместимости тканей предлагаемым нами способом, из 102 пар "донор-реципиент" - у 68 не обнаружены свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений в биологическом материале "донора", соединенном с биологическим материалом "реципиента", а у 34 пар "донор-реципиент" все же обнаружены свободные кислотоустойчивые тиоловые группы низкомолекулярных соединений в количестве от 6 до 12 мкмоль/л в биологическом материале "донора", соединенном с биологическим материалом "реципиента". Полученные результаты свидетельствовали о том, что предлагаемый нами способ более чувствителен, и, в отличие от способа-прототипа, позволяет на молекулярном уровне идентифицировать специфичность реакции антиген-антитело при определении биологической совместимости. Кроме того, предлагаемый нами способ в определенном смысле может интегрально оценить биологическую совместимость по антигенам, находящимся в соединенном In vitro биологическом материале "донора" и "реципиента". Сравнительная характеристика показателей способа-прототипа и предлагаемого нами способа представлена в таблице. Полученные данные свидетельствуют, что предлагаемый способ определения биологической совместимости, в отличие от способа-прототипа, позволяет одноэтапно и интегрально оценить биологическую совместимость; исключить ложноположительные и ложноотрицательные реакции; идентифицировать специфичность реакции преципитации и агглютинации; количественно оценивать результаты определения биологической совместимости по содержанию или отсутствию указанного выше молекулярного маркера. Таким образом, заявляемый способ позволяет упростить способ определения биологической совместимости тканей и повысить его чувствительность и точность.