Спосіб визначення важких металів

Предполагаемое изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине, токсикологии, ветеринарии, сельском хозяйстве в лабораторных условиях при исследовании биологических жидкостей и других ве ществ. Известен способ быстрого и простого определения в полевых условиях в питьевой и сточных водах, почве и донных отложениях, золе на уровне "мг/мл" кадмия, свинца, ртути и др. тяжелых металлов [Microbiological assay pad and kit for selective detection of toxicants: Патент ГДР №4026147, кл. С 12 Q 1 /02/Bitton G., Koopman В.; Academ. Wissen-Schaften DDR. - № 518686, кл. 435/288, заявл. 03.05.90 - прототип]. Способ основан на специфическом ингибировании тяжелыми металлами микробной бетагалактозидазы, что позволяет отличить тяжелые металла от химических веществ-неметаллов, которые бета-галактозидазу не инактивируют. Анализируемую пробу инкубируют в течение 90 мин при температуре 35°С с содержащими бета-галактозидазу клетками E.coll, каплю инкубационной смеси наносят на подложку из фильтрующего материала, пропитанную раствором хромогенного или флюорогенного субстрата, и по ослаблению интенсивности окраски по сравнению с таковой в контроле судят о наличии в пробе тяжелых металлов. Недостатком прототипа является низкая чувствительности (10-3 г/мл) и длительность проведения реакции взаимодействия маркерного фермента с образцами тяжелых металлов (90 мин). Задача изобретения: повышение чувствительности теста для расширения его функциональных возможностей. Для решения поставленной задачи проводят реакцию взаимодействия маркерного фермента с образцами тяжелых металлов. Для этого инкубируют анализируемые и контрольные образцы с маркерным ферментом, который предварительно сенсибилизируют на подложку из полистирола, и после удаления реакционной жидкости отмыванием определяют остаточную ферментативную активность по окрашиванию субстрата, который наносят на подложку. С удят о концентрации тяжелых металлов по активации маркерного фермента. Отличительными признаками предполагаемого изобретения являются; в качестве подложки используют полистирол; сенсибилизируют маркерный фермент на полистирол; проводит непосредственно на полистироле реакцию взаимодействия маркерного фермента с тяжелыми металлами; удаляют реакционную жидкость отмыванием; определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси; судят о содержании тяжелых металлов по активации маркерного фермента. Использование сенсибилизированного маркерного фермента (бета-галактозидаза, пероксидаза и др.) позволяет разработать высокочувствительные методы определения веществ в биологических жидкостях. Чувствительность анализа увеличивается до 10-9-10-10 г/мл по сравнению с реакциями в растворе {без процесса сенсибилизации). Это показано ранее для протеиназ: - Andrews A.T. A new approach to the general detection and measurement of the proteinase and proteinase inhibitor activities/Bloeh. ei bioph, acta - 1982. - V. 708. -P. 194-202; - Самохина Л.Μ., Дубинин А.А. Использование техники иммуноферментного анализа для определения протеиназ и их ингибиторов/Применение иммуноферментного анализа а медицине: Докл. респ, научн. конф. (Харьков, 28-29 ноября 1989 г.): Тез. докл. - Харьков, 1989. - С. 62. Кроме того, соли тяжелых металлов способны и ингибировать, и активировать маркерные ферменты. Это зависит от концентрации и времени взаимодействия реагентов. Пероксидаза (РХ), при условии ее иммобилизации на полистирол в концентрации 2 мкг/мл, значительно активируется тяжелыми металлами в концентрации 10-9-10-10 г/мл, для олова - при его концентрации до 10-8 г/мл. При этом время реакции составляет 10 мин. При повышении концентрации как тяжелых, так и других металлов наступает эффект ингибирования РХ. Увеличение времени реакции приводит к выравниванию эффекта солей тяжелых и других металлов на иммобилизированную РХ. Увеличение концентрации РХ до 4 мкг/мл д,ает возможность анализа тяжелых металлов по ингибированию и в концентрации 10-6-10-9 г/мл·. В свою очередь, снижение концентрации РХ до 1 мкг/мл приводит к уменьшению величины оптической плотности, а снижение времени реакции не обеспечивает достаточной стабильности и воспроизводимости результатов. Таким образом, использование возможности активации маркерного фермента солями тяжелых металлов позволяет определять наличие тяжелых металлов в ранге концентраций 10-9 -10-10 г/мл в течение 10 мин при использовании в качестве маркерного фермента РХ, сенсибилизированной на полистироле в концентрации 2 мкг/мл. Использование в качестве подложки полистирола дает возможность сокращения времени проведения анализа за счет возможной автоматизации процесса, одновременного микроанализа 40 исследуемых образцов в дубликате при использовании стандартных планшет. Отличительные признаки заявляемого решения соответствуют критерию "новизна" и требованиям изобретательского уровня. Проведенные исследования в отделе биохимии Института терапии АМН Украины и отделе молекулярных основ семиотики Институт биохимии Η АН Украины (г. Киев) показали, что использование данного способа по сравнению с прототипом позволяет определять тяжелые металлы (кадмий, олово, ртуть) в концентрации 10-910-10 г/мл по реакции активации маркерного фермента, повысить чувствительность анализа до 10-10 г/мл, уменьшить продолжительность реакции взаимодействия маркерного фермента с образцами тяжелых металлов до 10 мин и расширить функциональные возможности способа для его применения в научных и практических работах. Предложенный способ осуществляют следующим образом: 1. Сенсибилизируют маркерный фермент, например пероксидазу, на полистироловые планшеты в концентрации 2 мкг/мл путем высуши вания из раствора 0,33 Μ карбоната аммония при 37°С. Несвязавшийся фермент отмывают 2-3 раза водой с 0,05% Твин-20. 2. Проводят реакцию взаимодействия сенсибилизированного маркерного фермента с тяжелыми металлами. Для этого исследуемые пробы разводят в 2 и более раз (в зависимости от предполагаемого содержания тяжелых металлов) с помощью 1 Μ трис-HCI буфера рН 8,6. Отдельно готовят калибровочный материал: исходный раствор соли тяжелого металла, например олова или смеси известных солей, в концентрации 2 мг в 1 мл рабочего буфера и затем серию разведений от