Спосіб диференціації цирковірусів свиней і та іі серотипів за t-step-point-плр

Спосіб диференціації цирковірусів свиней І та ІІ серотипів за T-step-point-ПЛР, що включає використання як ПЛР-мішені гена rep, його ампліфікації шляхом використання праймерів PVC-1_2-F (5'CGAAGACGAGCGCAAGAAAATACG3') і PCV1_2-R (5'CCAATCACGCTTCTGC ATTTTCCC3') за температури відпалу 60 °С для ЦВС-ІІ та температури 55 °С для індикації обох серотипів і синтезу фрагмента довжиною 421 п.н. для ІІ серотипу та 408-421 п.н. для І серотипу цирковірусу свиней. (19) (21) u200703314 (22) 27.03.2007 (24) 27.08.2007 (46) 27.08.2007, Бюл. № 13, 2007 р. (72) Стегній Борис Тимофійович, Герілович Антон Павлович, Бабкін Михайло Валерійович (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 25809 щоб забезпечити ефективність способу. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок про те, що запропонований спосіб диференціації цирковірусів свиней на основі ампліфікації специфічної для II типу ділянки гену rep довжиною 421п.н. та 408-421п.н. ділянки І типу дозволяє виявити вірусний геном у досліджуваному клінічному матеріалі, що відповідає за чутливістю світовим аналогам та відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується наступним чином. Пробопідготовка. Як матеріал для дослідження використовують кров, стабілізовану цитратом натрію або розчином глюкози, внутрішні органи та змиви слизових оболонок від інфікованих свиней, а також культуральні розплодки вірусу: Екстракція загальної ДНК проводиться за допомогою набору для екстракції загальної ДНКСорб-А або ДНК-Сорб-Б (Амплисенс, Москва, Росія), або аналогічного. Процедура складається із лізису клітин та їх детриту, сорбції ДНК на сорбенті, дво-триразового відмивання сорбованої ДНК та екстракції ДНК із сорбенту за допомогою ТЕбуферу. Ампліфікація. Готують загальну (для усієї кількості проб) суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на 1 пробу): 19,5мкл деіонізованої води; 2,5мкл 50мМ Mg++; 10,0мкл реакційного буфер у; 5,0мкл суміші dNTP; 1мкл праймера PCV-1_2-F; 1мкл праймера PCV-1_2-R; 1мкл Taq-полімерази. Після додавання Taq-полімерази, що проводиться в останню чергу, ретельно перемішують суміш на вортексі. Додають у дозі 40мкл ампліфікаційної суміші в усі пробірки, підготовлені для ампліфікації. Після чого додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 25мкл) мінерального масла, вносять 10мкл розчину сумарної ДНК проби у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла для проведення ампліфікації. За іншим варіантом (сумарний реакційний об'єм 30мкл) використовують 25мкл реакційної суміші та 5мкл сумарної ДНК. Вносять у пробірку для негативного контрольного зразку - 10 (5)мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразку - 10 (5)мкл розчину ДНК з інактивованої формаліном культуральної розплодки ЦВС-ІІ. Пробірки закривають й центрифугують 3-5 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. Переносять пробірки в нагрітий до температури 95°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл.). Після закінчення реакції проводять електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР, за допомогою поділу фрагментів ДНК в агарозному гелі. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. В мірну колбу ємністю 1000,0см 3 вносять вміст пакету з буфером для електрофорезу, доводять 4 до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують до повного розчинення осаду. Приготування агарозного гелю. У конічну колбу ємністю 250см 3 вносять вміст одного пакету з агарозою, додають 100,0см 3 робочого розчину буфера ТБЕ і ставлять колбу на водяну баню. Доводять вміст колби до кипіння та повністю розтоплюють. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщува ти окремих нерозчинених часток. Розтоплену агарозу охолоджують до температури 50-60°С. У колбу з розчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміду етидія та перемішують рівномірними обертовими рухами. Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Гребінки розміщують на платформу на відстані 3см одна від одної. Охолоджену до температури 50°С агарозу заливають на платформу. Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) витягають гребінки, платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери. Заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ в електрофоретичну камеру так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки 4-5мм. Виставляють пробірки з продуктами ампліфікації у штатив послідовно. Для нанесення проби, відбирають 10мкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буферу ТБЕ так, щоб вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8В/см . Потім через 30-40 хвилин виймають платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дають рідині стекти з гелю і промивають агарозний гель дистильованою водою у кількості 200см 3 2-3 рази. Агарозний гель вміщують на скло УФтрансілюминатору і аналізують отримані результати. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі 310нм. Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) - смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) - одна смужка жовтогарячого кольору розміром 421 нуклеотидний залишок (н.з.) для ЦВС-П та 408421н.з. для загальної детекції. Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) (421н.з. для ЦВСІІ та 408-421н.з. для загальної детекції) свідчила про відсутність ЦВС в пробі, що аналізували. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (421н.з. для ЦВС-ІІ та 408-421н.з. для загальної детекції), свідчить про присутність ЦВС у пробі, що аналізували. Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка. Необхідно поставити не менш трьох негативних контролів на 5 25809 етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для оцінки чутливості та відтворюваності способу щодо ідентифікації ДНК цирковірусів свиней типів І та II, по-перше, вивчали можливість виявлення різної кількості специфічної ДНК. Дослідження проведені у порівняльному аспекті з використанням тест-системи для виявлення ЦВС-ІІ виробництва НВО «Нарвак», а також ізолятів ЦВС-ІІ, ідентифікованих цією тест-системою після різного числа пасажів у культурах клітин. Окрім того, були використані перещеплювані культури клітин РК-15 та СНЕВ, персистентно інфіковані на ЦВС-І. З'ясовано, що запропонований спосіб здатен виявляти навіть ДНК вірус у всіх пасажах в культурі клітин, а також у розведені до 1:10000 розплідки ЦВС-ІІ після 5 пасажів, що за чутливістю перевершує спосіб-прототип у два рази. Дослідження були 6 проведені триразове, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2. Для визначення специфічності способу було використано 10 проб клінічного матеріалу від інфікованих свиней і 5 - від інтактних. Для контролю специфічності способу використовували зразки ДНК хламідій, мікоплазм, герпесвірусу хвороби Ауєскі. Після ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг різної інтенсивності у всіх 10 пробах клінічного матеріалу, а також в треку позитивного контрольного зразку ДНК ЦВС-ІІ. Проби ДНК з клінічного матеріалу від здорових свиней після ампліфікації не давали смуг ампліконів. Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів також не утворювали специфічних смуг після реакції за способом, що пропонується. Розроблено високочутливий спосіб диференціації цирковірусів свиней І та II серотипів за Tstep-point-ПЛР, який може успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. Таблиця Спосіб диференціація цирковірусів свиней І та ІІ серотипів за T-step-point-ПЛР. № циклу 1 2 3 Температура 95°С 95°С 60°/55°С 72°С 72°С Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а Час 2хв 1хв 1хв 1хв 2хв Підписне Кількість циклів 1 40 1 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601