Спосіб виявлення рнк-вірусу ньюкаслської хвороби

Спосіб виявлення РНК-вірусу ньюкаслської хвороби, що включає екстракцію РНК, її зворотну транскрипцію та ампліфікацію кДНК-вірусу ньюкаслської хвороби в ділянці гена F, який відрізняється тим, що використовують праймери "NDVfusionFF" (5' AGG CCT CTT GCA GCT GC A G 3'), "NDVfusionRR" (5' GTT GCA ACC CCA AGA GCT АС А С 3') та "lasotafusionR" (5' GTT GCA ACC CCA AGA GCC АС А CC 3') за температури відпалу 60 та 62 °С і синтезу фрагмента довжиною 345 п.н. (19) (21) u200703315 (22) 27.03.2007 (24) 27.08.2007 (46) 27.08.2007, Бюл. № 13, 2007 р. (72) Стегній Борис Тимофійович, Герілович Антон Павлович (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 25810 Готують загальну (для усієї кількості проб) суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку (на 1 пробу): 13,5мкл деіонізованої води; 1,5мкл 50мМ Mg++; 5,0мкл реакційного буферу; 2,5мкл суміші dNTP; по 1мкл праймерів (NDVfusionFF + NDVfusionRR для індикації вірусу НХ та NDVfusionFF +lasotafusionR - у разі необхідності виявлення вакцинного штаму LaSota); 0,5мкл Taq-полімерази. Після додавання Taq-полімерази, що проводиться в останню чергу, одержану суміш ретельно перемішують на вортексі. Після чого, суміш у дозі 25мкл вносять в усі пробірки підготовлені для ампліфікації. Потім додають в усі пробірки по 1 краплі (близько 25мкл) мінерального масла. Для проведення ампліфікації у відповідну пробірку з реакційною сумішшю під шар масла вносять 5мкл розчину сумарної кДНК проби. Для негативного контрольного зразку в пробірку вносять - 5мкл деіонізованої води, а в пробірку для позитивного контрольного зразку - 5мкл розчину кДНК з інактивованої формаліном ембріональної розплодки вірусу Н Х. Пробірки закривають й центрифугують протягом 3-5 секунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. Переносять пробірки в нагрітий до температури 95°С програмний термостат (ампліфікатор) і проводять ампліфікацію за наступною програмою (табл.). Після закінчення реакції проводять аналіз продуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ДНК в агарозному гелі. Потім проводять електрофоретичний аналіз продуктів ПЛР. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) для електрофорезу. В мірну колбу ємністю 1000,0см 3 вносять вміст пакета з буфером для електрофорезу, доводять до мітки дистильованою водою та ретельно перемішують до повного розчинення осаду. Приготування агарозного гелю. У конічну колбу ємністю 250см 3 вносять вміст одного пакета з агарозою, додають 100,0см 3 робочого розчину буфера ТБЕ і ста влять колбу на водяну баню. Вміст колби доводять до кипіння, повністю розтоплюють, помішуючи скляною палочкою та охолоджують до температури 50-60°С. Отриманий розчин агарози повинен бути прозорим і не вміщува ти окремих нерозчинених часток. Після чого у колбу з розчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміду е тидія. Підготовка електрофоретичної камери до заливання агарозного гелю. Встановлюють гребінку на платформу, розміщуючи її на відстані 3см одна від одної та заливають у неї охолоджену до температури 50°С агарозу. Після застигання агарози (приблизно через 25-30хв.) обережно витягають гребінку; платформу з агарозним гелем переносять до електрофоретичної камери. В електрофоретичну камеру заливають необхідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він покривав агарозний гель шаром завтовшки 4-5мм. Для нанесення проби відбирають у кількості 10мкл продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб 4 вміст одного кармана агарозного гелю не перетікав у інший. Електрофорез проводять у градієнті напруги 8В/см. Потім виймають платформу з агарозним гелем з електрофоретичної камери, дають рідині стекти з гелю та промивають агарозний гель дистильованою водою у кількості 200см 3 2-3 рази. Агарозний гель вміщують на скло УФтрансілюминатору. Фрагменти аналізованої ДНК виявляються у вигляді смужок жовтогарячого кольору при проходженні УФ-випромінювання з довжиною хвилі 310нм. Облік результатів. У негативному контрольному зразку (К-) смужки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору. У позитивних контрольних зразках (К+) одна смужка жовтогарячого кольору розміром 345 нуклеотидний залишок (н.з.). Відсутність смужки жовтогарячого кольору на рівні позитивного контролю (К+) (345н.з.) свідчить про відсутність вірусу Н Х. Наявність смужки, що відповідає за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю (345п.н.), свідчить про присутність вірусу НХ. Результат аналізу не можна вважати достовірним, якщо на доріжці будь-якого негативного контролю виявляється специфічна смужка. Необхідно поставити не менше трьох негативних контролів на етапі виділення ДНК і стільки ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джерела контамінації. Ефективність способу розкривається в прикладах. Приклад 1. Для оцінки чутливості та відтворюваності способу щодо індикації РНК вірусу ньюкаслської хвороби по-перше, вивчали можливість виявлення різної кількості специфічної РНК різних штамів вірусу та LaSota зокрема. З цією метою досліджували штами ЛГ85 (9 log2 за РГА), LaSota (8 log2 за РГА) в різних розведеннях та польовий ізолят, виділений від крячка (8 log 2 за РГА). Запропонований спосіб дозволив виявити РНК вірусу ньюкаслської хвороби штамів ЛГ85 та LaSota з титром до 0,5 log2 за РГА, а польовий ізоляту - в розведенні що мало активність 2 log2 за РГА. Специфічна пара праймерів для ідентифікації штаму LaSota гібридизувалася лише з РНК цього штаму при 62°С. Дослідження були проведені дворазове, при повтореннях результати відтворені. Приклад 2. Для визначення специфічності способу було використано 10 позитивних та 5 негативних проб. Для контролю специфічності використовували зразки РНК вірусів грипу птиці різних субтипів та штам УМ-93 вірусу хвороби Гамборо. Після ампліфікації встановлено наявність специфічних смуг різної інтенсивності у всі х 10 позитивних пробах, а також в треку позитивного контрольного зразку РНК вірусу Н Х. З пробами РНК з матеріалу від інтактних курячих ембріонів після ампліфікації специфічні продукти реакції не утворювались. Проби сумарної РНК гетерогенних контролів також не утворювали специфічних смуг після реакції за способом, що пропонується. 5 25810 Розроблено спосіб виявлення РНК вірусу ньюкаслської хвороби за допомогою ПЛР, який може 6 успішно використовуватись у практиці лабораторних досліджень. Таблиця Спосіб виявлення РНК вірусу нюкаслської хвороби № циклу 1 2 3 Температура 95°С 95°С 60/62°С 72°С 72°С Комп’ютерна в ерстка М. Мацело Час 2хв 1хв 1хв 1хв 2хв Підписне Кількість циклів 1 40 1 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601