Спосіб диференціації генотипів сортів ячменю

Спосіб диференціації генотипів сортів ячменю, що включає молекулярно-генетичний аналіз на основі полімеразної ланцюгової реакції, який відрізняється тим, що як праймери використовують фрагменти ретротранспозонів (LTR-праймери) разом з праймерами з поряд розташованого простого мікросателітного повтору (ISSR-праймери). (19) (21) u200601816 (22) 20.02.2006 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. № 7, 2006 р. (72) Сиволап Юрій Михайлович, Календар Руслан Миколаєвич, Стратула Ольга Ромуальдівна (73) ПІВДЕННИЙ БІОТЕХНОЛОГІЧНИЙ ЦЕНТР У РОСЛИННИЦТВІ 3 16084 на мікрофузі «Eppendorf 5415». Надосадну рідину злити, осад промити двічі 0,5мл 70% етанолу центрифугувати при 14000об./хв. 2. Флюорометричне визначення концентрації ДНК. Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюорометрі «ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer» («Hoefer Scientific Instruments», США) у TNE-буфері (3M NaCL, 50mM Nа2HP04) у присутності флюоресцентного барвника Hoechst 33258. Осад розчинити у 100мкл ТЕ-буферу. 3. Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР проводити у 0,5мклепендорфах з використанням ампліфікатора «Терцик» («ДНК-технологія», Росія). Реакційна 4 суміш для ПЛР з REMAP-праймерами об’ємом 20мкл містить: 50mM KC1, 20mM Tpic-HCl pH 8.4 (250С), 3mM MgClz, 0,01% Tween 20,5% гліцерін, по 0,15mM кожного dNTP, 0,2mkM кожного праймера (послідовності наведені в таблицях 1 і 2), 20ng ДНК и 1 одиницю Taq-полімерази. Для ПЛР застосовувати наступний температурний режим: початкова денатурація - 1,5хв. при 940С, денатурація 30сек. при 940С, відпал - 40сек. при 600С, елонгація при 940С - 1хв. при 720С, заключна елонгація 10хв. при 720С. Кількість циклів ампліфікації - 35. Таблиця 1 LTR-праймери для проведення ПЛР № 1 2 3 4 5 7 8 9 10 Назва праймера NIKITA 1-57 92714 E 0229 С 2430 E 2082 С 0945 91673 С 0946 E 1814 Послідовність праймера (5’-3’) CGCATTTGTTCAAGCCTAAACC ATCATTGCCTCTAGGGCATAATTC ACGTCGGCATCGGGCTGTCAC TTGTTCCACCCACCGTCTACTTGC GGGTCGCATATTGGGCGTGAC GCAAGCTTCCGTTTCCGC TGTGACAGCCCGATGCCGACGTTCC TTCCGTTTGGACTCCGTTCC TTCCCATGCGACGTTCCCCAAC Назва ретротранспозона NIKITA BARE l SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA SUKKULA SABRINA BARE l Таблиця 2 ISSR-праймери для проведення ПЛР № 1 2 3 Назва праймера R2 R8 R9 Послідовність праймера (GA)9C (АОС)6G (AG)9C 4. Елетрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації. Продукти ПЛР-ампліфікації розділяти в 2% агарозному гелі. Далі гелі з ПЛР-продуктами фарбувати бромістим етидієм і фотографувати в УФ-світлі на фотоплівку „Мікрат 300”. Розміри фрагментів ДНК визначати за допомогою системи відеодокументації «Image Master VDS» в п. н. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Диференціація сорту Росава за допомогою REMAP-методу. Для дослідження поліморфізму використовували ПЛР-метод REMAP з двома парами праймери. Перша пара -Е0229 +R8. При використанні цих праймери кількість поліморфних локусів складала 3 (розмір фрагментів -555, 486 і 232 п.н.). Кількість детектованих генотипів в межах сорту - 6. Друга пара праймери -С2430 +R2. При Комп’ютерна верстка М. Мацело використанні цих праймери поліморфний локус був 1 (розмір фрагменту - 798 п.н.), а кількість детектованих генотипів в межах сорту складала 2. Встановлено внутрішньосортовий поліморфізм сорту Росава. Проаналізований сорт є гетерогенним за 4 локусами. Приклад 2. Диференціація сорту Південний за допомогою REMAP-методу. Для дослідження поліморфізму використовували ПЛР-метод REMAP з використанням пари праймери: Е0229 +R 8. При використанні цих праймери кількість поліморфних локусів складала 2 (розмір фрагментів -232 і 200 п.н.). Кількість детектованих генотипів в межах сорту - 4. Встановлено внутрішньосортовий поліморфізм сорту Південний. Проаналізований сорт є гетерогенним за 2 локусами. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601