Спосіб виявлення днк вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби

Спосіб виявлення ДНК вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби, що включає ампліфікацію ДНК вірусу ІРТ як ПЛР-мішені, який відрізняє ться тим, що використовують праймери IRTV_F(E) (5'GCT TCG GTC GAC ACG GTC ТT') і IRTV_R(E) (5'CTT TGT CGC CCG TTG AGT CG 3') до гена gE та Taq-полімеразу за температури відпалу 55 °С і синтезу фрагмента довжиною 265 п.н. (19) (21) u200703312 (22) 27.03.2007 (24) 27.08.2007 (46) 27.08.2007, Бюл. № 13, 2007 р. (72) Герілович Антон Павлович, Стегній Борис Тимофійович, Кучерявенко Роман Олексійович (73) НАЦІОН АЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ" 3 25808 4 перемішують на вертексі. Після чого,суміш у дозі льору при проходженні УФ-випромінювання з дов40мкл вносять в усі пробірки підготовлені для амжиною хвилі 310нм. пліфікації. Потім додають в усі пробірки по 1 краплі У негативному контрольному зразку (К-) смуж(близько 25мкл) мінерального масла. Для провеки відсутні. Поява смужки на рівні позитивного кондення ампліфікації у відповідну пробірку з реакційтролю свідчить про контамінацію (забруднення) ною сумішшю під шар масла вносять 5мкл розчину компонентів набору. сумарної ДНК проби. Для негативного контрольноУ позитивних контрольних зразках (К+) одна го зразку в пробірку вносять - 5мкл деіонізованої смужка жовтогарячого кольору розміром 265 нукводи, а в пробірку для позитивного контрольного леотидний залишок (н.з.). зразку - 5мкл розчину ДНК з інактивованої формаВідсутність смужки жовтогарячого кольору на ліном культуральної розплодки вірусу ІРТ. Пробіррівні позитивного контролю (К+) (265 н.з.) свідчить ки закривають й центрифугують протягом 3-5 сепро відсутність вірусу ІРТ. Наявність смужки, що кунд при 2000об/хв на мікроцентрифузі. відповідає за електрофоретичною рухливістю поПереносять пробірки в нагрітий до температури зитивному контролю (265 п.н.), свідчить про прису95°С програмний термостат (ампліфікатор) і протність вірусу ІРТ. Результат аналізу не можна вваводять ампліфікацію за наступною програмою жати достовірним, якщо на доріжці будь-якого (табл.): негативного контролю виявляється специфічна Після закінчення реакції проводять аналіз смужка. Необхідно поставити не менше трьох непродуктів ПЛР, шляхом поділу фрагментів ДНК в гативних контролів на етапі виділення ДНК і стільагарозному гелі. Потім проводять електрофоретики ж на етапі постановки ПЛР для виявлення джечний аналіз продуктів ПЛР. рела контамінації. Приготування робочого розчину буфера (ТБЕ) Ефективність способу розкривається в придля електрофорезу. кладах. В мірну колбу ємністю 1000,0см 3 вносять вміст Приклад 1 пакета з буфером для електрофорезу, доводять Для оцінки чутливості та відтворюваності сподо мітки дистильованою водою та ретельно пересобу щодо індикації ДНК вірусу ІРТ по-перше, вимішують до повного розчинення осаду. вчали можливість виявлення різної кількості спеПриготування агарозного гелю. У конічну колцифічної ДНК. Дослідження були проведені у 3 бу ємністю 250см вносять вміст одного пакета з порівняльному аспекті з використанням набору агарозою, додають 100,0см 3 робочого розчину для реакції імунофлуоресценції для виявлення буфера ТБЕ і ста влять колбу на водяну баню. ДНК вірусу ІРТ. Досліджували негативні та позитиВміст колби доводять до кипіння, повністю розтопвні за РІФ зразки сперми, а також культуральні люють, помішуючи скляною палочкою та охолорозплодки вірусу з різним титром. джують до температури 50-60°С. Отриманий розЗ'ясовано, що запропонований спосіб здатен чин агарози повинен бути прозорим і не вміщува ти виявляти навіть ДНК вірусу у всі х пасажах в кульокремих нерозчинених часток. Після чого у колбу з турі клітин, а також у розведені до 1:100000 розрозчином агарози вносять 50,0мкл розчину броміплідки ІРТ з титром 8,9 lg ТЦД50 /см 3, що за чутлиду е тидія. вістю перевершує аналогову методику в два рази. Підготовка електрофоретичної камери до заДослідження були проведені триразове, при поливання агарозного гелю. Встановлюють гребінку втореннях результати відтворені. на платформу, розміщуючи її на відстані 3см одна Приклад 2 від одної та заливають у неї охолоджену до темДля визначення специфічності способу було ператури 50°С агарозу. Після застигання агарози використано 10 проб клінічного матеріалу від інфі(приблизно через 25-30хв.) обережно витягають кованих тварин і 5 - від інтактних. гребінку; платформу з агарозним гелем переноДля контролю специфічності способу викориссять до електрофоретичної камери. товували зразки ДНК герпесвірусів індичок, хвороВ електрофоретичну камеру заливають необби Марека та хвороби Ауєскі. хідну кількість розчину буфера ТБЕ так, щоб він Після ампліфікації встановлено наявність спепокривав агарозний гель шаром завтовшки 4-5мм. цифічних смуг різної інтенсивності у всіх 10 пробах Для нанесення проби відбирають у кількості 10мкл клінічного матеріалу, а також в треку позитивного продукту ампліфікації та вносять у відповідну лунконтрольного зразку ДНК вірусу ІРТ. З пробами ку агарозного гелю, під шар буфера ТБЕ так, щоб ДНК клінічного матеріалу від здорової великої ровміст одного кармана агарозного гелю не перетігатої худоби після ампліфікації не утворювалось кав у інший. смуг ампліконів. Електрофорез проводять у градієнті напруги Проби сумарної ДНК гетерогенних контролів 8В/см. Потім виймають платформу з агарозним також не утворювали специфічних смуг після реагелем з електрофоретичної камери, дають рідині кції за способом, що пропонується. стекти з гелю та промивають агарозний гель дисРозроблено спосіб виявлення ДНК вірусу інтильованою водою у кількості 200см 3 2-3 рази. фекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби за Агарозний гель вміщують на скло УФдопомогою ПЛР, який може успішно використовутрансілюминатору. Фрагменти аналізованої ДНК ватись у практиці лабораторних досліджень. виявляються у вигляді смужок жовтогарячого ко 5 25808 6 Таблиця Спосіб виявлення днк вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби № циклу 1 2 3 Температура 95°С 95°С 55°С 72°С 72°С Комп’ютерна в ерстка В. Мацело Час 2 хв 1 хв 1 хв 1 хв 2 хв Підписне Кількість циклів 1 40 1 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601