Спосіб визначення генотипу кластера генів апо a-i-ciii-a-iv

29129 Винахід відноситься до медицини, зокрема до кардіології, генетики, і може бути використаним в стаціонарних і амбулаторних умовах при прове-денні епідеміологічних досліджень для визначення ймовірності генетичної детермінації дисліпопроте-їдемії. Відомий спосіб визначення генотипу генного кластера апо А-І-С-ІІІ-А-ІV (див. Ordovas J.M., Gas-sidy D.K., Civera F. et al. Familial apolipoprotein AI, CIII and AIV deficiency and premature atherosclerosis due to deletion of a gene complex on chromosome II // S. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264. - № 28. Р. 16339-16340) - прототип, який включає дослі-дження крові і виявлення генетичного маркера атеросклерозу шляхом визначення дезоксірібону-клеїнової кислоти (ДНК) поліморфізму кластера ге-нів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV за сайтом рестрикції PST 1. Для цього з лімфоцитів виділяють ДНК, проводять полімеразну ланцюгову реакцію, яка складається з трьох стадій: плавлення ДНК, синтезу ДНК і відпа-лу праймерів. Потім проводять електрофорез в агарозному гелі і оцінюють дослідження в ультра-фіолетовому спектрі. Тривалість дослідження від 48 до 72 годин. Недоліком прототипу є його складність, трива-лість проведення реакції і необхідність реактивів, які дорого коштують, та спеціального обладнання. Крім того, відомий спосіб може бути проведений тільки спеціально підготовленим досвідченим спе-ціалістом. Задача винаходу: спрощення способу вияв-лення генотипу кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV з метою можливості виявлення первинної дисліпоп-ротеїдемії. Для вирішення цієї задачі авторами пропо-новано спосіб визначення генотипу кластера генів апо А-І-СІІІ-А-ІV, який включає дослідження крові з подальшим виявленням генетичного маркера дисліпопротеїдемії шляхом визначення ДНК-полі-морфізму кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV за сайтом рестрикції PST 1. В процесі дослідження крові визначають показники ліпідного спектру, розрахо-вують для кожного з них прогностичний коефіцієнт (ПК). Потім по значенню суми вказаних ПК судять про наявність чи відсутність сайту рестрикції PST1, по якому прогнозують розвиток імовірність генетичної детермінації первинної дисліпопротеїдемії. Відмінними ознаками винаходу є: в процесі до-слідження крові визначають показники ліпідного спектру; за рівнем показників ліпідного спектру розраховують для кожного з них прогностичний коефіцієнт (ПК); виявлення генетичного маркера дисліпопротеїдемії здійснюють за допомогою ви-значення суми вказаних ПК; при значенні суми ПК, яка дорівнює мінус 13 і більше, судять про відсут-ність сайту рестрикції PST1 для доклінічної діагно-стики дисліпопротеїдемії. Використання показників ліпідного обміну, які є фенотипічним проявом генотипу, для визначення ДНКполіморфізму кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV за сайтом рестрикції PST 1 зумовлено тим, що в основі розвитку атерогенних порушень ліпідного обміну часто лежать мутації в генах, що контро-люють метаболізм ліпідів. Встановлено, що мута-ції в генах, які відповідають за синтез білків ліпоп-ротеїдів (апобілків), ключових ферментів ліпідного обміну або білків клітинних рецепторів ліпопротеї-дів здатні визивати дисліпопротеїдемії різного ха-рактеру і ступеню вираженості. Мутації кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV в сайті PST1 фенотипично проявляються високим рівнем загального холестерину, тригліцеридів і знижен-ням вмісту ліпопротеїдів високої щільності (ЛПВЩ) і характеризуються більш ранньою маніфестацією первинних дисліпопротеїдемій. Тому по рівню показників ліпідного спектру мо-жливо без проведення складної полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР) порівняно з прототипом ви-значення невідомого генотипу з метою проведення доклінічної діагностики і профілактики дисліпопро-теїдемії. Відмінні ознаки відповідають критерію "новиз-на" і вимогам винахідницького рівня. Дослідження за способом, що пропонується, проведені в клініці Інституту терапії АМН України на 104 хворих. Проведені дослідження показали, що значення суми ПК, яке дорівнює мінус 13 і бі-льше, відповідає відсутності сайту рестрикції PST1, по якому прогнозують розвиток дисліпопро-теїдемії. Рівень надійності способу складає 95%. Використання пропонованого рішення в меди-чній практиці дозволяє спростити методику вияв-лення генотипу кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV і дає можливість прогнозувати можливість виявлен-ня первинної дисліпопротеїдемії (ДЛП), здійснити доклінічну діагностику та профілактику дисліпоп-ротеїдемії. Як графічний матеріал представлено номо-граму визначення прогностичного коефіцієнту (ПК) для виявлення генотипу кластера генів, що дослі-джувався. Спосіб, що пропонується, здійснюють таким чином: 1. Проводять забір венозної крові натще і визначають в ній ферментативним методом рівень показників ліпідного спектру: загального холесте-рину (ЗХС), тригліцеридів (ТГ), холестерину ліпоп-ротеїдів високої щільності (ХС ЛПВЩ). 2. Розрахо-вують вміст холестерину ліпопротеїдів низької щільності (ХС ЛПНЩ) і коефіцієнту атерогенності (КА) по формулам: æ ТГ ö ХС ЛПНЩ = ЗХС - ç ХС ЛПВЩ + ÷ (1) 5 ø, è ЗХС - ХС ЛПВЩ (2). ХС ЛПВЩ , 3. Розраховують для кожного з показників ліпідно-го спектру крові прогностичний коефіцієнт (ПК) за методикою неоднорідної послідовної процедури Вальда-Генкіна (див. Е.В. Гублер. Вычислитель-ные методы анализа и распознавание патологи-ческих процессов. - Л.: Медицина, 1978). Резуль-тати розрахунку представлені в вигляді номограми визначення ПК для виявлення генотипу кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV. 4. Визначають по номограмі суму вказаних ПК. 5. Визначають наявність чи від-сутність сайту рестрикції PST1 і виявляють атеро-генний генотип генного кластера, що досліджував-ся, по сумі ПК. 6. При значенні суми ПК, яке дорів-нює мінус 13 і більше, КА = 29129 виявляють відсутність сайту рестрикції PST1, по якому визначають імовірність розвитку ДЛП і атеросклерозу, і при значенні суми ПК, яке дорівнює плюс 13 і більше, виявляють наявність сайту рестрикції PST1. Можливість здійснення пропонованого способу підтверджується прикладом. Приклад. Обстежений Н., 42 роки, поступив в клініку Інституту терапії АМН України зі скаргами на давлячі, пекучі болі за грудиною з іррадіацією в ліву лопатку, які виникають з частотою 1-2 рази на добу після фізичної напруги і психоемоційної пе-ренапруги. Болі купіруються прийомом нітрогліце-рину. В анамнезі життя: застудні захворювання, грип, ангіни, аппендектомія. Обстежений Н. має обтяжену спадковість по ІХС і мозковому інсульту, не палить, алкоголем не зловживає. Об'єктивно при обстеженні: стан задовільний, шкіра і слизові оболонки звичайного кольору. Периферичних набряків немає. Серцева діяльність ритмічна, І тон на верхівці злегка послабле-ний, систолічний м'який дуючий шум на верхівці, акцент ІІ тону на аорті. ЧСС 78 уд./хв., АТ - 150/90 мм рт. ст. За способом, що пропонується, у обстеженого Н. визначали показники ліпідного обміну і про-гностичний коефіцієнт (ПК) по номограмі. Резуль-тати дослідження: ЗХС - 260 мг/дл, ПК - мінус 1,5; ТГ - 211 мг/дл, ПК - мінус 6,5; ХС ЛПДНЩ 42,2 мг/дл, ПК мінус 9,5; КА 6,02, ПК – мінус 12,0; ХС ЛПВЩ 37 мг/дл, ПК мінус 8,0; ХС ЛПНЩ - 188,8 мг/дл, ПК - мінус 3,8. Сума вказаних ПК дорівнює мінус 41,3. Таке значення ПК свідчить про відсутність сайту рест-рикції PST1 і можливість розвитку первинної ДЛП і раннього атеросклерозу у обстеженого Н. Заключення: дослідження за способом, що пропонується, дозволяють спростити методику ви-явлення генотипу кластера генів апо А-І-С-ІІІ-А-ІV і дають можливість здійснити доклінічну діагности-ку ДЛП і рекомендувати профілактичні міри. 29129 Таблиця Признак ХС ЛПВЩ (мг/дл) ТГ (мг/дл) ХС ЛПДНЩ (мг/дл) КА ЗХС (мг/дл) ХС ЛПНЩ (мг/дл) Інтервал 50,6 216 40,1 5,61 266 201 Діагностичний коефіцієнт -11,6 -8,0 -1,5 +0,8 +9,9 -1,5 +6,45 +0,8 -1,1 -6,5 -14,0 +6,5 +0,6 -1,1 -8,0 -9,5 +10,0 +4,7 +0,4 -0,1 -12,0 +9,0 +1,3 -1,5 -4,0 +7,0 +2,8 -0,4 -3,8 -2,0 Інформативність 5,192 4,503 4,5 4,178 1,123 1,067