Спосіб виготовлення еритроцитарного антитільного діагностикуму для виявлення термостабільного ентеротоксину e. coli

Спосіб виготовлення антитільного еритроцитарного діагностикуму для виявлення термостабільного ентеротоксину Е.соlі, що 3 30127 включає імунізацію кон'югатом термостабільного і термолабільного ентеротоксинами, отримання антитоксичної сироватки, виділення моноспецифічних до термостабільного ентеротоксину антитіл шляхом використання для імунізації кон'югату ентеротоксинів, а для вилучення високоафінних антитіл-імуносорбенту на основі термостабільного ентеротоксину, щоб забезпечити ефективність способу. Спосіб виконується таким чином: Від тварин імунізованих кон'югатом термостабільного і термолабільного ентеротоксинів отримують сироватку крові, виділяють високоспецифічні антитіла до термостабільного ентеротоксину за допомогою імуносорбенту, який готують таким чином: до 10мл розчину термостабільного ентеротоксину додають бичачий сироваточний альбумін у кількості 150200мг, ретельно перемішують, і додають по краплям, при постійному перемішуванні 2,0мл 2,5% глутаральдегіду, суміш залишають на 2-3 години при кімнатній температурі і 12-15 годин при температурі 4°С для формування гелю. Полімеризовані білки (гель) суспензують в 0,2М фосфа тному буфері і гомогенізують продавлюючи ін'єкційним шприцом через голки з різним діаметром, або в гомогенізаторі Поттера, суспензію центрифугують 10 хвилин при 5000об/хв. і 4°С, а осад тричі ресуспензують у фосфа тному буфері и промивають елюіруючим розчином (0,2 н.СН3СООН, 0,1М HCL-гліциновим буфером з рН 2,5 або 3М NH4SCN) до тих пір, поки оптична щільність надосадкової рідини при 280нм не стане менше 0,02. Гель ретельно 3-4-разово відмивають забуференим фізрозчином (рН 7,2) від залишків вільного токсину і незшитих білків шляхом центрифугування при 8000об/хв.,15 хв. Відмивання повторюють 3-4 рази з 0,1М гліцинНСІ буфером (рН 2,5) і 2 рази з забуференим фізрозчином, консервують імуносорбент азидом натрію (1:10000). Готовий імуносорбент додають до антитоксичної сироватки у співвідношенні: 10мл сорбенту на 1мл антисироватки, суміш перемішують 30-40 хвилин при кімнатній температурі, невідсорбований матеріал вилучають, промивають суспензію декілька разів забуференим фізіологічним розчином, а відсорбовані антитоксини знімають з імуносорбенту, суспензують його в елюіруючих розчинах два-три рази доки в розчині не перестане виявлятися білок. Концентрацію білка визначають спектрофотометричним методом. Далі готують еритроцитарний діагностикум. Для цього еритроцити великої рогатої худоби суспензують в консервуючому розчині Алсевера, тричі відмивають і ресуспензують у фосфатносолевому буфері з рН 7,2 до 2% концентрації, в якості фіксуючої речовини при обробці еритроцитів використовують 5% розчин формальдегіду за методом Weinbach, для підвищення відсорбційної властивості і аглютинабельності еритроцитів проводять їх обробку танином (1:20000, 20-40хв., 37°С), еритроцити сенсебілізують елюатом моноспецифічних антитіл до термостабільного ентеротоксину у співвідношенні 1:1 протягом 30 4 40хв., рН 6,4, і відмивають фізрозчином від непрореагувавших антитіл, для стабілізації еритроцитарного антитільного діагностикуму використовують гліцерин у концентрації 0,5%. У якості контролю при визначенні термостабільного ентеротоксину Е.соlі використовують еритроцити імобілізовані імуноглобулінами одержаними із нормальної кролячої сироватки. Приклад 1 Специфічність діагностикума до STентеротоксину Е.соlі вивчають в реакції пасивної гемаглютинації. Реакцію проводять у мікротитраторі Такачи мікрометодом в об'ємі 25мкл. В кожну лунку мікротитратора вносять 0,15М забуференний фізрозчин (рН 7,2), після чого досліджувані проби розводять від 1:2 до 1:128 і в кожну лунку додають по 25мкл еритроцитарного діагностикуму, суміш струшують і залишають на 2 години при 37°С, а потім ще на 16-18 годин при кімнатній температурі. У якості контролю використовуютьпроби з термолабільним ентеротоксином Е.соlі. Облік реакції аглютинації проводять візуально по 4-х бальній системі: ++++ - чітка аглютинація у прозорій рідині, +++ - дрібні скупчення часток у прозорій рідині, ++ - дрібні скупчення часток у мутній рідині, + - ледве помітні частки у мутній рідині, - - аглютинація відсутня, рідина рівномірно мутна. За позитивну реакцію вважають аглютинацію не менше ніж на ++. Контроль - негативний. Приклад 2 Визначали титр ST-ентеротоксину в фекаліях новонароджених телят, з ознаками гострої діареї, і вмістом кишечника загиблих телят, за допомогою еритроцитарного діагностикума на основі антитіл до кон'югату ентеротоксинів Е.соlі, методом РПГА. Для контролю антигену використовували ліофілізований очищений ST-ентеротоксин Е.соlі з концентрацією білка 100мкг/мл, а для контролю діагностикума-еритроцити великої рогатої худоби імобілізовані імуноглобулінами нормальної кролячої сироватки крові (табл.1). Приклад 3 Порівнювали методи визначення титру STентеротоксину у фекаліях новонароджених телят, з ознаками гострої діареї, і вмістом тонкого кишечника загиблих телят, за допомогою латексного (прототип) і еритроцитарного діагностикумів на основі антитіл до кон'югату ентеротоксинів Е.соlі, методом РПГА (Табл.2). Використання кон'югату термостабільного і термолабільного ентеротоксинів Е.соlі для імунізації тварин дозволяє отримати з сироватки їх крові високоафінні антитіла до термостабільного ентеротоксину, які вилучають із олігоспецифічної сироватки за допомогою імуносорбенту і готують на їх основі еритроцитарний антитільний діагностикум для визначення термостабільного ентеротоксину у культуральних рідинах штамівпродуцентів, фекаліях хвори х тварин, а також у вмісті тонкої кишки тварин, що загинули від ентеротоксичної діареї. 5 30127 6 Таблиця 1 Спосіб виготовлення еритроцитарного антитільного діагностикуму для виявлення термостабільного ентеротоксину Е.соlі Метод індикації Еритроцитарний антитільний діагностикум Досліджуваний матеріал Фекалії Вміст кишечнику Контроль антигену Фекалії Вміст кишечнику Еритроцити імобілізовані антитілами Контроль нормальної кролячої антигену сироватки Кількість Кількість позитивних проб проб у РПГА з діагностикумом 10 70 10 80 Титр ST-ентеротоксину у РПГА з діагностикумом 1:2 + + 1:4 + + 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 + + ± ± + + ± ± 10 100 + + + + + 10 10 0 0 10 0 Позначення: + позитивна реакція аглютинації; ± проміжна реакція аглютинації; - негативна реакція аглютинації Таблиця 2 Спосіб виготовлення еритроцитарного антитільного діагностикуму для виявлення термостабільного ентеротоксину Е.соlі Використовуваний діагностикум Латексний діагностикум Еритроцитарний діагностикум Досліджуваний матеріал Кількість проб Фекалії Вміст кишечнику Фекалії Вміст кишечнику 10 10 10 10 Кількість Титр ST-ентеротоксину у РПГА з позитивних діагностикумом проб у РПГА з 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 діагностикумом 60 + + + + ± 70 + + + + + ± 70 + + + + ± ± 80 + + + + ± ± Позначення: + позитивна реакція аглютинації; ± проміжна реакція аглютинації; - негативна реакція аглютинації