Спосіб одержання діагностикуму для виявлення туляремійних антитіл

Спосіб одержання туляремійного діагностикуму, що включає дестр укцію бактеріальних клітин вакцинного штаму туляремійного мікроба оброб 3 24567 ру барвника та його концентрації, що не змінює біологічні властивості АГ, потребує мінімальних об'ємів компонентів, забезпечує підвищення специфічності та чутливості, що веде до здешевлення одержаного діагностикуму. Задача досягається тим, що інактивація культури вакцинного штаму туляремійного мікроба проводиться хімічним способом - 0,7-1,5% розчином формаліну, наступного очищення зависі центрифугуванням, відмивання в ізотонічному фізіологічному розчині та фарбування АГ розчином барвника на основі гематоксиліну протягом доби на водяній бані. Після фарбування АГ кількаразово відмивають центрифугуванням фізіологічним розчином та доводять до кінцевої концентрації. Запропонований спосіб одержання туляремійного діагностикуму для мікрореакції аглютинації (МРА) реалізують наступним чином. Проводять багаторазові пасажі культури вакцинного туляремійного штаму на елективних поживних середовищах - щільне жовткове середовище Мак-Коя (2-3пасажі) та туляремійний ФТагар (4-5 пасажів). Накопичену бакмасу з концентрацією мікробів 5×1011м.к./мл інактивують формаліном) 0,7-1,5% формаліну, з експозицією при температурі 22±0,5°С протягом 2 годин, після чого клітини відмивають від формаліну ізотонічним фізіологічним розчином, центрифугуючи одноразово 20-30 хвилин при 6 000об./хв. Формалін в обраному діапазоні концентрації діє як інактивуючий агент, не пошкоджуючи антигенну структуру клітин; оптимальною концентрацією був 1% розчин формаліну. Одержаний після центрифугування осад ресуспендують фізіологічним розчином, доводячи концентрацію зависі до 2,5-5¸109м.к./мл за ГСЗ мутності та змішують з рівним об'ємом розчину на основі гематоксиліну, який готують заздалегідь, використовуючи метод Караччі (0,1г гематоксиліну розчиняють в у 100мл дистильованої води, додають 25мл гліцерину, 5,0г калійних квасців та одержують розчин вишневого кольору). Процес обробки антигену фарбуючим розчином проводять протягом 22-24год. на водяній бані при температурі 56°С, періодично перемішуючи завись. На наступному етапі виконують процес очищення препарату від баластних речовин, відмиваючи фізіологічним розчином 3-4 рази при 6 000об./хв. 20-30 хвилин. При одержанні прозорого безкольорового надосадкового шару його зливають, а очищений пофарбований осад ресуспендують у фізіологічному розчині до оптимальної концентрації 2,5-5×109м.к./мл за галузевим стандартом зразком мутності, додаючи при цьому розчин формаліну до кінцевої концентрації 0,1%. Одержаний діагностикум використовується у мікрореакції аглютинації (МРА) при визначенні туляремійних антитіл (AT), має високу специфіч 4 ність та чутливість, потребує мінімальних об'ємів компонентів для виконання реакції та короткого терміну виконання. Завдяки контрастному забарвленню, комплекс „антиген + антитіло" визначається неозброєним оком; зберігається у рідкому стані протягом 5 років (термін спостереження), не втрачаючи своїх особливостей (термін придатності аналогу - туляремійного діагностикуму для об'ємної PA - 3 роки). У порівнянні заявленої корисної моделі, що базується на МРА, з найближчий аналогом - діагностикум для об'ємної реакції аглютинації (РА), заявлений діагностикум має більш високі показники чутливості у 100% випадків; затрати часу при виконанні реакції у 5-6 разів менше, а також при виконанні МРА потребує у 3-4 рази менше досліджуваної сироватки, ніж при РА. У порівнянні з реакцією пасивної гемаглютинації (РПГА), аналогом - туляремійним еритроцитарним антигенним діагностикумом, заявлений препарат виявляє розбіжності приблизно у 30% випадків, що в таких реакціях є нормою. Приклад 1. Завись бактерій туляремійного вакцинного штаму змішували з 1% розчином формаліну, з експозицією при температурі 22±10,5°С протягом 2 годин, після чого клітини відмивали від формаліну ізотонічним фізіологічним розчином, центрифугуючи одноразово 20хвилин при 6000об./хв. Одержаний після центрифугування осад ресуспендували фізіологічним розчином, доводячи концентрацію зависі до 2,5×109м.к./мл за галузевим стандартом зразком (ГСЗ) мутності та змішували з рівним об'ємом розчину на основі гематоксиліну, який був приготований заздалегідь. Обробку антигену фарбуючим розчином проводили протягом 22 год. на водяній бані при температурі 56°С, періодично перемішуючи завись. На наступному етапі виконують процес очищення препарату від баластних речовин, відмиваючи фізіологічним розчином 3-4 рази при 6 000 об./хв. 20 хвилин. Очи щений пофарбований осад ресуспендували у фізіологічному розчині до оптимальної концентрації 2,5×109м.к./мл за галузевим стандартом зразка мутності, додаючи при цьому розчин формаліну до кінцевої концентрації 0,1%. Таким чином, одержано антигенний рідкий туляремійний діагностикум для МРА з концентрацією клітин 2,5×109м.к./мл. У МРА з сироватками людей, щеплених живою туляремійною вакциною, одержано наступні результати, які підтверджують високу специфічність (відсутність антитіл з бруцельозною діагностичною сироваткою) та чутливість (титри антитіл) заявленого діагностикуму (Табл.): 5 24567 6 Таблиця Порівняльний аналіз активності заявленого діагностикуму з найближчим аналогом Титри антитіл № сироватки Вік Період після щеплення (роки) 1 48 3 МРА 1:32 PA 1:8 2 52 3 1:128 1:20 3 72 4 1:64 1: 16 4 51 4 1:16 1:8 5 54 4 1:64 1: 16 6 1:4000 1:2400 7 негативні негативні Примітки: Сироватки №№6,7 - контроль: №6 - МРА з діагностичною туляремійною сироваткою №7 - МРА з бруцельозною діагностичною сироваткою Джерела інформації: 1. Діагностикум туляремійний антигенний сухий. ФС 42-325 ВС-90. 2. Патент РФ №2221591. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Дата подачи заявки: 2003.01.27. Заяви Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко тель (патентообладатель): Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В. Да та публикации: 2004.01.20. 3. Діагностикум туляремійний рідкий для об'ємної реакції аглютинації у пробірках. ФС 42-314 ВС-90. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601