Спосіб визначення активності протеїназ та альфа-і-інгібітора протеїназ в біологічних рідинах

Спосіб визначення активності протеїназ та альфа-1-інгібітора протеїназ в біологічних рідинах, що включає інкубацію субстрату протеолітичної реакції з контрольними та дослідними зразками 30277 Вибір для одночасного визначення таких показників, як активність протеїназ, a-1-ІП або трипсинінгібіторна активність обумовлений участю протеїназ поряд з їх інгібіторами у основних процесах життєвої діяльності організму [1, 2]. Відомо, що особливу роль грають реакції лімітованого протеолізу в системі протеїназа-a-1-інгібітор протеїназ, які приймають участь в утворенні активних форм ферментів, білків або пептидів з різними фізіологічними функціями. Використання в якості субстрату протеолітичної реакції гемопротеїдів, наприклад метгемоглобіну, забезпечує підвищення специфічності визначення a-1-ІП, можливість одночасного дослідження активності протеїназ [3, 4]. Вказаний ефект обумовлений тим, що метгемоглобін є високомолекулярною сполукою, яку не здатні гідролізувати пептидази біологічних рідин. Крім того, такі білки складаються з багатьох різноманітних амінокислот, тому значна частина протеїназ буде знаходити сайти специфічності до їх конкурентного зв'язування. Використання метгемоглобіну в якості субстрату протеолітичної реакції також обумовлено тим, що гемопротеїди каталізують реакцію розщеплення перекису водню з утворенням активного кисневого радикалу, який окислює ортофенілендіамін. Реакція йде з поступовим насиченням інтенсивності забарвлення, яка зупиняється доданням сірчаної кислоти. Вказані властивості гемопротеїдів визначаються наявністю гема і білкової частини. Дія протеїназ призводить до порушення як білкової частини, так і дісоціації гема, який забезпечує яскраве забарвлення. Перевага метгемоглобіну порівняно з іншими гемопротеїдами обумовлена його дешевизною, а також можливістю отримання за звичайних лабораторних умов. Відмінні ознаки запропонованого рішення відповідають критерію "новизна" та вимогам винахідницького рівня. Дослідження, які проведені за запропонованим способом в інституті терапії АМН України підтверджують, що його впровадження у медичну практику забезпечує специфічність визначення a-1-ІП з чутливістю 10-7 г/мл, можливість одночасного визначення активності протеїназ і a-1-ІП або загальної трипсинінгібіторної активності, що сприяє уніфікації досліджень та поширює галузь застосування способу. Достовірність запропонованого способу становить 95%. Запропонований спосіб здійснюють наступним чином. 1. Готують контрольні та дослідні зразки: сироватку/плазму крові розводять у 100-250 разів 0,01 М фосфатносолевим буфером рН 7,2-7,6 з 0,01% твину-20, контрольні зразки розчинів трипсину у концентрації 0,1-8 мкг/мл у тому ж буфері. Вносять їх у лунки планшетів в об'ємі по 50 та 25 мкл, відповідно для визначення активності протеїназ та a-1-ІП. 2. У лунки планшету, призначеного для визначення активності a-1-ІП, додають по 25 мкл розчину трипсину у концентрації 8 мкг/мл та інкубірують при 25°С протягом 15 хв. 3. Додають субстрат протеолітичної реакції, в якості котрого використовують гемопротеїди, наприклад метгемоглобін у концентрації 20 мкг/мл, по 50 мкл у кожну лунку та інкубірують при 37°С протягом 15 хв. 4. До суміші додають розчин, який містить ортофенілендіамін і пергидроль, по 100 мкл у лунку та інкубірують при 20°С протягом 5 хв до появи яскравого забарвлення. 5. Зупиняють реакцію доданням 50% сірчаної кислоти по 25 мкл у лунку. 6. Реєструють оптичну густину спектрофотометричним методом при 490 нм. 7. По результатам вимірювань контрольних зразків будують калібровочний графік, який використовують для визначення активності протеїназ або залишкової активності трипсину при визначенні активності a-1-ІП. 8. Визначають активність протеїназ і a-1-ІП з урахуванням розведення зразків. Можливість використання запропонованого способу демонструється прикладом. Приклад Визначення активності протеїназ та a-1-ІП або загальної трипсинінгібіторної активності в біологічних рідинах Дослідні зразки біологічної рідини, наприклад, слини або сироватки крові, розведеної у 100 разів 0,01 М фосфатносолевим буфером рН 7,2-7,6 з 0,01% твину-20 вносять у лунки планшету, призначеного для визначення активності протеїназ в об'ємі 50 мкл. У лунки полістіролового планшету, призначеного для визначення a-1-ІП, вносять по 25 мкл біологічної рідини (розведення змінюють в залежності від концентрації інгібіторів) і потім додають по 25 мкл розчину трипсину у концентрації 8 мкг/мл та інкубірують при 20°С 15 хв. Стандартні розчини трипсину вносять по 50 мкл. В якості стандарту використовують розчин трипсину в тому ж буфері у концентрації 0,1-8 мкг/мл. Додають по 50 мкл у лунку розчину метгемоглобіну у концентрації 20 мкг/мл та інкубірують при 37°С 15 хв. Потім додають по 100 мкл у лунку субстратної суміші, яку готують у слідуючій послідовності (із розрахунку на 1 планшет): 1-2 мг ортофенілендіаміна розчиняють у 12 мл 0,1 М цитратного буферу рН 4,5-4,6 і додають 5-10 мкл пергідроля. Зупиняють реакцію через 5 хв доданням по 25 мкл у лунку 50% сірчаної кислоти. Реєструють оптичну густину при 490 нм на багатоканальному мікроспектрофотометрі. По результатам вимірювань стандартних розчинів будують калібровочний графік, який використовують для визначення активності протеїназ або залишкової активності трипсину при визначенні a1-ІП у дослідних зразках. Розрахунок активності протеїназ проводять за формулою: A × 100 × 60 × 1000 (г / л × г ) , 15 × 1000000 де А - величина, визначена по калібровочному графіку, мкг/мл, 100 - розведення зразків, 15 - час протеолітичної реакції, хв, 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л, 1000000 - коефіцієнт перерахунку у грами. 2 30277 Активність a-l-ІП або загальну трипсинінгібіторну активність в біологічних рідинах розраховують за формулою: (8 - В) × 100 × 1000 × 60 г / л × г , 15 × 1000000 де 8 - концентрація трипсину, доданого до зразків, В - залишкова концентрація трипсину, визначена по калібровочному графіку, 100 - розведення зразків, 15 - час протеолітичної реакції, хв, 60 - коефіцієнт перерахунку на 1 годину, 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1 л, 1000000 - коефіцієнт перерахунку у грами. Висновок: запропонований спосіб забезпечує можливість одночасного визначення активності протеїназ та a-1-ІП, що сприяє уніфікації досліджень. Джерела інформації 1. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии.- Киев: Здоровья. - 1988. - 198 с. 2. Berninger R.W. a-1-antitrypsin/Protease inhibitors of human plasma. Biochemistry and pathophysiology // J. Med. - 1985.- 16, № 1-2-3. - P.1-416. 3. Andrews A.T. A new approach to the general detection and measurement of the proteinase and proteinase inhibitor activities // Bioch. et bioph. acta. 1982. - 708. - P. 194-202. 4. Andrews A.T. A no vel, highly sensitive and rapid assay system for proteolytic enzymes // FEBS Letters. - 1982. - 141, № 2. - P. 207-210. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3