Спосіб визначення активності протеїна 3 або їх інгібіторів в біологічних рідинах

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для диагностики заболеваний. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. Получают кон*ьюгат субстрата (на пример, альбумина) и маркерного фермента (например, пероксидазы) Полученный KOHV югат наносят путем нековалентной адсорбции из водного раствора на микротитровальный полистирольный планшет. Далее в каждую лунку сенсибилизированнного таким образом планшета вносят анализируемый раствор протеиназ и инкубируют 15 - 20 мин при 37°С После инкубации реакционную смесь отделяют, планшет промывают и в каждой лунке определяют остаточную активность маркерного фермента по стандартной методике, используемой в варианте "ELISA" метода ИФА По уменьшению активности судят об активности протеиназ. Чувствительность способа составляет 10~10 г/мл трипсина и химотрипсина, калибровочный график линеен в интервале 10*9-10"6 г/мл, коэффициент вариации не превышает 10% Для определения ингибиторов протеиназ проводят предварительную реакцию образования комплекса фермент - ингибитор со стандартным раствором протеиназы т С СЛ сл о о * Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для диагностики заболеваний. Целью изобретения является ускорение и упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. 1. Получают иммобилизованный фермент - субстратный комплекс. В качестве 22-91 ферментной метки используют пероксидазу хренз,/ї - глюкозидазу и др. Первоначально синтезируют растворимый (неиммобилизоваиный) фермент - субстратный комплекс одним из химических методов Наиболее распространенным и эффективным является перйодатный метод. Далее полученный фермент - субстратный комплекс сенсибилизируют на полистироловой твердой фазе путем инкубации раствора в полистироло 1655991 вых микротитровальных планшетах при 37°С в течение 3 - 4 ч при 4°С 1 6 - 18 ч. 2. Проводят протеолитическую реакцию, Для этого в лунки планшета с иммобилизованным фермент - субстратным 5 комплексом вносят раствор протеиназ. Инкубируют при 37°С 15 - 20 мин. При определении ингибиторов протеиназ отдельно на титровальной доске проводят предварительно реакцию образования комплекса 10 фермент-ингибитор: кО,2 мл разбавленной плазмы или другой биологической жидкости (рэзведение регулировать в зависимости от предполагаемого содержания ингибитора) добавляют 0,2 мл раствора трипсина 15 (10 мкґ/мл для альфз-1-ингибитора протеиназ человека при определении его в сыворотке крови), инкубируют 15 мин при 20°С, затем реакционную смесь вносят в лунки планшета и проводят протеолитическую ре- 20 акцию. 3. После инкубации реакционную смесь отделяют отмыванием дистиллированной водой с 0,05% Твин-20 или другими анало25 гичными детергентами. 4. Остаточную ферментативную активность определяют на твердой фазе. В отмытые лунки планшета добавляют раствор субстрата. Например, при использовании в качестве "маркерного" фермента перокси- 30 даэы хрена в лунки вносят субстратную смесь, состоящую из хромогена (о-фенилёндиамин и др), пероксида водорода и цитратного буфера рН 4,6 - 5,0. Через 5 - 1 0 мин инкубации при 20°С реакцию останавлива- 35 ют добавлением 50%-ной серной кислоты и измеряют оптическую плотность при 492 нм (для о-фенилендиамина). Концентрацию протеиназ (ингибиторов протеиназ) в образцах определяют по' калибровочной кри- 40 вой, которую строят с использованием стандартных растворов трипсина (ингибиторов трипсина). Качественную оценку результатов можно проводить визуально. П р и м е р 1. Определение общей трип- 45 тической активности. Кон'ьюгат пероксидазы хрена - бычий сывороточный альбумин (ПХ-БСА) получают перйодатиым методом. Раствор конъюгата ПХ-БСА в 0,2 М кар- 50 бонаіном буфере рН 9,6 (концентрация 3 мкг/мл) вносят по 0,2 мл в лунки полистиролоного микротитровального планшета и инкубируют 4 ч при 37°С. После отмывания планшета водой, содержащей 55 0,05% Твин-20, в лунки вносят по 0,2 мл раствора протеиназ а 0,01 М фосфатно-солевом буфере рН 7,6 с 0.1% Твин-20 (концентрации в пределах 0,002 - 2,0 мкг/мл) и инкубируют 20 мин при 37°С. Затем план шет отмывают водой с 0,05% Твин-20 и вносят в лунки планшета по 0,2 мл раствора субстратной смеси, приготовленной предварительно следующим образом (в расчете на один планшет): 2 мг ортофенилендиамина растворяют в 25 мл 0,05 М цитратного буфера рН 4,6 и добавляют 10 мкл пергидроля, Цветную реакцию на планшете проводят в течение 5 - 1 0 мин при 20°С и останавливают добавлением по 0,05 мл в лунку 50%'ной серной кислоты. Измеряют оптическую плотность при 492 нм. По результатам измерения стандартных растворов трипсина строят калибровочную кривую, по которой определяют содержание протеиназ в исследуемом образце. П р и м е р 2. Определение альфа-1-ингибитора протеиназ. Конъюгат ПХ-БСА, полученный перйодатным методом, в 0,02 М карбонатном буфере рН 9,6 (концентрация 2,5 мкг/мл) вносят по 0,2 мл в лунки планшета и инкубируют 3 ч при 37°С. После этого планшет отмывают водой с 0,05% Твин-20. Отдельно на титровальной доске проводят реакцию связывания ингибитор протеиназы - протеиназа. Для этого в исследуемую сыворотку, которую предварительно разводят в 250 раз 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,6 с 0.1% Твин-20, смешивают с равным объемом раствора трипсина в том же буфере (концентрация 5 мкг/мл) и инкубируют 15 мин при 20°С. Затем эти растворы, а также стандартные растворы трипсина (концентрации в пределах 0.002 - 2,0 мкг/мл) вносят по 0,2 мл в лунки отмытого после инкубации с конъюгатом планшета и инкубируют 15 мин при 37°С. Планшет отмывают водой с 0,05% Твин-20 и вносят по 0,2мл раствора субстратной смеси (2 мг ортофенилендиамина растворяют в 25 мл 0,05 М цитратного буфера рН 4,6 с 10 мкл пергидроля). После проведения цветной реакции в течение 5 - 10 мин при 20°С добавляют по 0,05 мл в лунку 50%-ной серной кислоты для остановки реакции и измеряют оптическую плотность при 492 им. Строят калибровочную кривую, по которой определяют остаточную концентрацию трипсина. Исходя из того, что 1 моль трипсина взаимодействует с 1 моль ингибитора, содержание эяьфа-1-ингибитора протеиназ определяют по формуле Си = -Сост) -250 • 1000 , . : ^QQQ (мкмоль/л) } где Си - концентрация альфа-1-ингибитора протеиназ; 9 1655991 билиэовзнного на нерастворимом носителе 5 - концентрация трипсина, добавковалентного комплекса маркерный ферленного в образцы; мент-белковый субстрат, проведение протеСост. - концентрация трипсина, не свяолитической реакции между определяемой завшегося с ингибитором; протеиназой и иммобилизованным комп250 - разведение образцов; 5 лексом, отделение продуктов протеолитиче1000 - коэффициент пересчета на 1 л ской реакции и определение сыворотки; ферментативной активности маркерного 24000 - молярная масса трипсина. фермента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с Чувствительность способа составляет целью ускорения и упрощения способа, ко10 10" г/мл трипсина и химотрипсинэ, кали^- 10 валентный комплекс маркерный фермент ровочный график линеен в диапазоне 10 белковый субстрат иммобилизуют на поли10 г/мл, коэффициент вариации не стирольной твердой фазе путем нековаленпревышает 10%. тной адсорбции, отделение продуктов протеолитической реакции осуществляют 15 Формула изобретения отмыванием и ферментативную активность Способ определения активности протемаркерного фермента определяют на полиинзз или их ингибиторов в биологических стирольной твердой фазе. . жидкостях, включающий получение иммо Редактор Т. Лазоренко Составитель А. Семенов Техред М.Моргентал Корректор О. Кундрик Заказ 2939/ДСП Тираж 193 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101