Спосіб визначення важких металів в біологічних рідинах та розчинах

Предлагаемое изобретение относится к биохимии и может быть использовано в медицине, токсикологии, ветеринарии, сельском хозяйстве в лабораторных условиях при исследовании биологических жидкостей и други х ве ществ. Известен способ (прототип) быстрого и простого определения в полевых условиях в питьевой и сточных водах, почве и донных отложениях, золе на уровне "мг/мл" кадмия, свинца, ртути и др. тяжелых металлов [Пат. ГДР №4026147, кл. С 12 Q 1/02 (Academ.Wissen-Schaften DDR. - №518686; заявл. 03.05.90; НКИ 435/288) // Ре ф.журн. – "Биотехнология". - 1993. - №6 - Р1653П]. Способ основан на специфическом ингибировании последними микробной бета-галактозидазы и позволяет отличить тяжелые металлы от химических веществ-неметаллов, которые бета-галактозидазу не инактивируют. Анализируемую пробу инкубируют в течение 90 мин при температуре 35°С с содержащими бета-галактозидазу клетками E.coli, каплю инкубационной смеси наносят на подложку из фильтрующего материала, пропитанную раствором хромогенного или флюорогенного субстрата, и по ослаблению интенсивности окраски по сравнению с таковой в контроле судят о наличии в пробе тяжелых металлов. Недостатком прототипа является низкая чувстви тельность (10 г/мл) и длительность проведения реакции ингибирования (90 мин). Задача изобретения: повышение чувствительности теста для расширения его функциональных возможностей. Для решения поставленной задачи проводят реакцию ингибирования маркерного фермента и определяют остаточную ферментативную активность по окрашиванию субстрата, нанесенного на подложку. При этом в качестве подложки используют полистирол, на который сенсибилизируют маркерный фермент. Реакцию ингибирования проводят непосредственно на полистироле. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле после удаления реакционной жидкости отмыванием. Отличительными признаками предлагаемого изобретения являются: - В качестве подложки используют полистирол, - Сенсибилизируют маркерный фермент на полистирол. - Проводят реакцию ингибирования непосредственно на полистироле. - Удаляют реакционную жидкость отмыванием, - Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси. Использование сенсибилизированного маркерного фермента (бета-галактозидаза, пероксидаза и др.) позволяет разработать высокочувствительные методы определения веществ в биологических жидкостях. Чувствительность анализа увеличивается до 10-9-10-12 г по сравнению с реакциями в растворе (без процесса сенсибилизации). Это показано ранее для протеиназ: - Andrews А.Т. A new approach to the general detection and measurement of the proteinase and proteinase inhibitor activities//Bioch. et bioph. acta. - 1982. - V.708. - P. 194-202; Самохина Л.М., Дубинин A.A. Использование техники иммуноферментного анализа для определения протеиназ и их ингибиторов//Применение иммуноферментного анализа в медицине: Докл.респ.научн.конф. (Харьков, 28-29 ноября 1989 г.): Тез.докл. - Харьков, 1989. - С.62; Самохіна Л.М. Стан системи протеіназа-альфа-1-ІнгІбітор протеіназ при холодовому і адреналовому стресі у щурів / Автореф.дисерт. на здобуття вчен.ст. канд.біол.наук. - Харків, 1994. - 16 с. Использование в качестве подложки полистирола дает возможность как сокращения времени проведения анализа непосредственно каждой пробы, так и одновременного микроанализа 40 исследуемых образцов в дубликате при использовании стандартных планшет. Отличительные признаки заявляемого решения соответствуют критерию "новизна" и требованиям изобретательского уровня. Проведенные исследования в отделе биохимии Института терапии АМН Украины и отделе молекулярных основ семиотики Института биохимии НАН Украины (г.Киев) показали, что использование данного способа позволяет определять тяжелые металлы (ртуть, кадмий, олово), а также повысить чувствительность анализа до 10-9 г/мл, уменьшить продолжительность реакции ингибирования до 10 мин и расширить, функциональные возможности способа для его применения в научных и практических работах. Предложенный способ осуществляют следующим образом: 1. Сенсибилизируют маркерный фермент, например пероксидазу, на полистироловые планшеты в концентрации 4 мкг/мл путем высуши вания из раствора 0,13 М карбоната аммония при 37°С. Несвязавшийся фермент отмывают 2-3 раза водой с 0,05% Твин-20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Для этого исследуемые пробы разводят в 2 и более раз (в зависимости от предполагаемого содержания тяжелых металлов) с помощью 1М трис-HCI буфера pH 8,6. Отдельно готовят калибровочный материал: исходный раствор соли тяжелого металла, например ртути или смеси известных солей, в концентрации 2 мг в 1 мл рабочего буфера и затем серию разведений от 0,5 до 0,001 мкг в 1 мл. Наносят калибровочный материал и исследуемые пробы на планшет, подготовленный по п.1, и затем инкубируют в термостате 10 мин при 37°С. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания, как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге. 4. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления субстратной смеси, содержащей цитратный буфер, ортофенилендиамин и пергидроль. Инкубируют при комнатной температуре до 5 мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты. 5. Измеряют оптическую плотность на многоканальном микроспектрофотометре при 490 нм. По результатам измерений калибровочного материала строят калибровочный график, который используют для определения содержания тяжелых металлов в пробах. Основные характеристики способа: - Чувствительность - 10-9 г; - Интервал линейности калибровочного графика – 10-7-10-9г; - Воспроизводимость - коэффициент вариации не превышает 10%. Пример 1. Способ определения ртути. 1. Сенсибилизируют пероксидазу на полистироловые планшеты в концентрации 4 мкг/мл путем высушивания из раствора 0,13 М карбоната аммония при 37°С. Несвязавшийся фермент отмывают 2-3 раза водой с 0,05% Твин-20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Для этого исследуемые пробы разводят в 2 и более раз (в зависимости от предполагаемого содержания ртути) с помощью 1 М трис-HCI буфера pH 8,6. Отдельно готовят калибровочный материал: исходный раствор соли ртути в концентрации 2 мг/мл рабочего буфера и затем серию разведений от 0,5 до 0,001 мкг и 1 мл. Наносят калибровочный материал в исследуемые пробы на планшет, подготовленный по п.1, и затем инкубируют в термостате 10 мин при 37°С. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания, как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге. 4. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления по 200 мкл в лунку субстратной смеси, приготовленной перед использованием и содержащей 25 мл 0,1 М цитратного буфера pH 4,5-4,6, 4 мг ортофенилендиамина и 20 мкл пергидроля (на 1 планшет). Инкубируют при комнатной температуре до 5 мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты по 50 мкл в лунку. 5. Измеряют оптическую плотность на многоканальном микроспектрофотометре типа Flow (Великобритания) при 490 нм. По результатам измерений калибровочного материала строят в полулогарифмической системе координат калибровочный график, который используют для определения содержания ртути в пробах. Пример 2. Способ определения тяжелых металлов. 1. Сенсибилизируют пероксидазу на полистироловые планшеты в концентрации 4 мкг/мл путем высушивания из раствора 0,13М карбоната аммония при 37°С. Несвязавшийся фермент отмывают 2-3 раза водой с 0,05% Твин-20. 2. Проводят реакцию ингибирования. Для этого исследуемые пробы разводят в 2 и более раз (в зависимости от предполагаемого содержания тяжелых металлов) с помощью 1 М трис-НСІ буфера pH 8,6. Отдельно готовят калибровочный материал: смесь солей ртути, олова, кадмия, содержащей по 2 мг каждой соли растворяют в 3 мл рабочего буфера и затем готовят серию разведений от 0,5 до 0,001 мкг/мл (можно делать дополнительные калибровочные кривые для отдельных тяжелых металлов или другие варианты). Наносят калибровочный материал и исследуемые пробы на планшет, подготовленный по п.1, и затем инкубируют в термостате 10 мин при 37°С. 3. Удаляют реакционную жидкость путем стряхивания и отмывания, как описано в п.1. Просушивают планшет на фильтровальной бумаге, 4. Определяют остаточную ферментативную активность на полистироле путем добавления по 200 мкл в лунку субстратной смеси, приготовленной перед использованием и содержащей 25 мл 0,1 М цитратного буфера pH 4,5-4,6, 4 мг ортофенилендиамина и 20 мкл пергидроля (на 1 планшет). Инкубируют при комнатной температуре до 5 мин. Останавливают реакцию добавлением 50% серной кислоты по 50 мкл в лунку. 5. Измеряют оптическую плотность на многоканальном микроспектрофотометре типа Flow (Великобритания) при 490 нм. По результатам измерений калибровочного материала строят в полулогарифмической системе координат калибровочный график, который используют для определения содержания тяжелых металлов (ртути, олова, кадмия) в пробах.