Спосіб визначення форми патології ниркового алотрансплантата

Спосіб визначення форми патології ниркового алотрансплантата, що включає приготування гістологічних зрізів нефробіоптату, їх фарбування за методами Банфф-класифікації, мікроскопічне дослідження зрізів та визначення в них морфологічних змін, який відрізняється тим, що готують додаткові зрізи, виконують їх імуногістохімічне фарбування з використанням моноклональних антитіл до CD45R0-антигену активованих Т-лімфоцитів та СD68-антигену моноцитів/макрофагів, фотографують зрізи, одержане зображення аналізують за допомогою комп'ютерних програм Adobe Photoshop 8.0 і Image J 1.34s, та визначають кількість активованих Тлімфоцитів (Т), моноцитів/макрофагів (М) і площу СD68-імунопозитивного матеріалу в полі зору (П), після чого результати оцінки стану алотрансплантата за критеріями Банфф U 2 (19) 1 3 30693 4 результати оцінки стану алотрансплантату за які ізольовані з периферійної крові пацієнта не критеріями Банфф-класифікації та завжди достовірно відбиває стан процесів, котрі імуногістохімічного фарбування порівнюють. відбуваються саме в нирковому алотрансплантаті. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю Крім того, добре відомо, що саме морфологічне ознак, що заявляються, та технічним результатом дослідження нефробіоптату є «золотим полягає у такому. стандартом» в діагностиці форм патології Оцінка результатів імуногістохімічного ниркового алотрансплантату. фарбування за допомогою системи аналізу Найбільш близьким за технічною сутністю та зображення у напівавтоматичному режимі результатом, що досягається, є спосіб, який дозволяє підрахувати кількість активованих Тполягає у приготуванні гістологічних зрізів лімфоцитів, моноцитів/макрофагів та площу СD68нефробіоптату, їх фарбуванні згідно з імунопозитивного матеріалу в полі зору. Ці рекомендаціями Банфф-класифікації, тобто, показники дозволяють (у сукупності з даними гематоксилін-еозином, PAS та трихроматичним оцінки нефробіоптату згідно до Банффбарвником (наприклад, за Масоном), класифікації) чітко визначити форму патології мікроскопічному дослідженні зрізів та визначенні ниркового алотрансплантату. морфологічних змін [Solez К., Axelsen R.A., Спосіб здійснюють таким чином. Benediktsson H. et al. International standardization of Готують парафінові зрізи нефробіоптатів criteria for the histologic diagnosis of renal allograft завтовшки 3-4 мікрони та поміщують їх на rejection: the Banff working classification of kidney предметні стекла (по 4-6 зрізів на скло). transplant pathology //Kidney Int. - 1993. - V.44. Фарбують рутинними гістологічними P.411-422]. барвниками 7 стекол: гематоксилін-еозіном - 3 Спільними суттєвими ознаками найближчого скла; перийодною кислотою - реактивом Шиффа аналогу і корисної моделі, що заявляється, є такі: (PAS) - 3 скла, а також одним з трихроматичних приготування гістологічних зрізів барвників - 1 скло. Зрізи досліджуються у нефробіоптату, світлооптичному мікроскопі та морфологічні зміни - фарбування зрізів згідно з рекомендаціями оцінюються за шкалою Банфф-2005. Банфф-класифікації, Додаткові стекла фарбують імуногістохімічно з - мікроскопічне дослідження гістологічних використанням для першого скла - первинних зрізів нефробіоптату; мишиних моноклональних антитіл до CD45R0- визначення морфологічних змін. антигену активованих Т-лімфоцитів, для другого Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому скла - первинних мишиних моноклональних що завдяки різноманітності форм патології антитіл - до СD68-антигену моноцитів/макрофагів. ниркового алотрансплантату, та їх поєднанню у Потім на зрізи наносяться вторинні антитіла, які одного пацієнта, особливо у пізньому коньюговані з пероксидазою, та діамінобензидин післяопераційному періоді, критерії цієї для візуалізації реакції. Зрізи дофарбовуються класифікації часто не дозволяють достовірно гематоксиліном та помішуються у бальзам. визначити форму патології ниркового Аналізують один зріз на скло; під мікроскопом алотрансплантату, що викликало необхідність у розробці нових способів. при збільшенні ´400 у корковій речовині нирок В основу корисної моделі поставлено задачу методом систематичного випадкового отбору удосконалення способу визначення форми відбирають 10 полів зору. Зображення патології ниркового алотрансплантату шляхом фотографують за допомогою цифрової приготування додаткових зрізів, їх фарбування фотокамери, потім вводять в комп'ютер для спеціальними методами, які забезпечують зберігання та наступної обробки. Для аналізу виявлення ознак того чи іншого типу дисфункції, а зображення використовують програми Adobe також використання системи аналізу зображення Photoshop 8.0 (Adobe Systems Inc.) и Image J 1.34s для надання шкалі оцінки кількісного характеру, (Nat. Inst. of Health, USA). При цьому підраховують що у сукупності сприятиме підвищенню якості кількість СD45R0-імунопозитивних активованих Твизначення форми патології. лімфоцитів в полі зору (Т), кількість СD68Поставлена задача вирішується тим, що у імунопозитивних моноцитів/макрофагів (М) та способі, який включає приготування гістологічних абсолютну площу (mm2) СD68-імунопозитивного зрізів нефробіоптату, їх фарбування згідно до матеріалу в полі зору (П). Результати оцінки стану рекомендацій Банфф-класифікації, тобто, алотрансплантату за критеріями Банффгематоксилін-еозином, PAS та за Масоном, класифікації та імуногістохімічного фарбування мікроскопічне дослідження зрізів та визначення порівнюються, причому: при Т=16±1, кількість морфологічних змін, новим є те, що готують клітин, додаткові зрізи, виконують їх імуногістохімічне М=23±2, кількість клітин, фарбування з використанням моноклональних П=374±32, mm2, антитіл CD45R0-антигену активованих Тстан ниркового алотрансплантату оцінюється лімфоцитів та СD68-антигену як нормальний; моноцитів/макрофагів, фотографують зрізи, при Т=94±13, одержане зображення аналізують за допомогою М=36±4, комп'ютерних програм Adobe Photoshop 8.0 і Image П=939±102, J 1.34s, та визначають кількість активованих Твизначають судинну патологію лімфоцитів, моноцитів/макрофагів і площу CD68алотрансплантату; імунопозитивного матеріалу в полі зору, після чого 5 30693 при Т=180±11, М=94±6, П=2275±304, визначають неспецифічний запальний процес, не пов'язаний з відторгненням алотрансплантату; при Т=188±14, М=53±4, П=1677±142, визначають хронічну реакцію відторгнення алотрансплантату; при Т=150±16, М=64±9, П=1347±181, визначають неспецифічний запальний процес у поєднанні з хронічним відторгненням алотрансплантату; при Т=202±13, М=65±6, П=1590±173, визначають гостру реакцію відторгнення на тлі хронічного відторгнення алотрансплантату. Приклад. У пацієнта П., 22 років, діагностовано порушення функції ниркового алотрансплантату, виконана нефробіопсія. При дослідженні гістологічних зрізів нефробіоптатів фарбованих згідно з рекомендаціями Банффкласифікації виявлено фіброз інтими артерій та рідкі мононуклеарні клітини у інтимі, що може мати місце як при хронічному відторгненні алотрансплантату, так і при атеросклеротичному ураженні ниркових артерій. Додаткові зрізи були фарбовані моноклональними антитілами до CD45R0-антигену активованих Т-лімфоцитів, та до СD68-антигену моноцитів/макрофагів. Після аналізу 10 полів зору були виявлені такі середні показники: Т=81, кількість клітин, М=32, кількість клітин, П=1067, mm2. Ці показники вказують на атеросклеротичне пошкодження ниркових артерій. Впровадження способу визначення форми патології ниркового алотрансплантату, що пропонується, дозволить підвищити якість діагностики видів дисфункції ниркового алотрансплантату. Це сприятиме вибору найбільш адекватного методу лікування, відновленню функції алотрансплантату, та його збереженню, що дозволяє запобігти повернення хворого до діалізу або повторної трансплантації. 6