Спосіб отримання позитивної контрольної сироватки до вірусу грипу птиці

Спосіб отримання позитивної контрольної сироватки до вірусу грипу птиці на сорокадобових курчатах, що не мають антитіл до грипу птиці та найбільш поширених збудників вірусних хвороб птахів (інфекційного бурситу, хвороби Гамборо, інфекційного ларинготрахеїту, віспи, рео- та аденовірусної хвороби, інфекційного бронхіту), який відрізняється тим, що вн утрішньом'язово вводять експериментальну вакцину ″АвіФлуВакІЕКВМ″ серії № 8, отриману з штамів вірусу грипу птиці, виділених у АР Крим. (19) (21) u200711909 (22) 29.10.2007 (24) 25.03.2008 (46) 25.03.2008, Бюл.№ 6, 2008 рік (72) БІЛЯВЦЕВА ОЛЕНА АНАТОЛІЇВН А, U A, ВОРОТІЛОВА Н АДІЯ ГРИГОРІВНА, UA, ІОНКІНА ІРИНА БОРИСІВН А, U A, БОЛДИРЄВ АНДРІЙ ДМИТРОВИЧ, U A, СТЕГНІЙ БОРИС ТИМОФІЙОВИЧ, UA, МУЗИКА ДЕНИС ВАСИЛЬОВИЧ, UA (73) КРИМСЬКА ДОСЛІДНА СТАНЦІЯ НАЦІОН АЛЬНОГО НАУКОВОГО ЦЕНТРУ "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ", U A 3 31027 5. Для серологічної діагностики грипу птиць запропоновано ряд тестів, які основані на виявленні антитіл у хворих або перехворівших птахів: реакція затримки гемаглютинації (РЗГА), полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Однак, найбільш чуттєвим є метод імуноферментного аналізу (ІФА) (Eliza-enzyme - linked immunosorbent assay) [5]. Найближчий аналог. Описано спосіб отримання позитивної сироватки до вірусу хвороби Ньюкасла (ВХН). Як антиген використовують вакцинний живий мезогенний штам "Комаров ВХН-К". Штам розмножують в алантоїсній порожнині 10-11 денних курячих зародків (КЗ), отриманих від стад, вільних від інфекції ВХН. Зразки жовтків, що відбирають з яєць, тестують на присутність антитіл до ВХН в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА). Всі зразки - негативні. Від охолоджених зародків після їх загибелі або на 4 добу після інокуляції ВХН відбирають алантоїсну рідину і використовують як джерело вірусу після визначення титру гемаглютининів та інфекційного титру. Курчатам 2,5 недільного віку, вільних від антитіл до ВХН інокулюють інтраокулярно 0,1см 3 просвітленої алантоїсної рідини (log4 ЕІД50) ВХН-К. Титри сироватки в РЗГА проти ВХН-К становлять в межах 1:256-1:512 із 4 гемаглютинуючими одиницями вакцинного вірусу. Позитивну сироватку використовують для ідентифікації інших ізолятів ВХН [9]. Метою наши х досліджень була розробка способів отримання діагностичної позитивної контрольної сироватки до вірусу грипу птиць для використання при проведенні серологічних досліджень, зокрема в РЗГА і ІФА. Поставлена мета досягається шляхом імунізації сорокадобових курчат, вільних від специфічних антитіл до найбільш поширених вірусних хвороб птахів, вакцинним інактивованим штамом вірусу грипу птиць. Опис запропонованого способу. Методика виготовлення позитивної специфічної сироватки до вірусу грипу птиць. Підготовка штаму для імунізації. У роботі використовують експериментальну серію інактивованої вакцини "АвіФлуВак ІЕКВМ" (серія №2, 3, 6 дата виготовлення 2006) [2, 3, 5]. Препарат знаходиться в емульгованому стані. Продуцентами позитивної сироватки є сорокадобова птиця кросу "Шевер-579". Птиця з однодобового віку утримується в умовах ізолятору. В досліді використано 220 голів. Попередньо курчат двічі досліджено в реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) на наявність специфічних антитіл до вірусів інфекційного бурситу і бронхіту, хвороби Ньюкасла, інфекційного ларинготрахеїту, рео- та аденовірусної хвороби, віспи, хвороби Марека, інфекційної анемії та енцефаломієліту. В РЗГА- на наявність специфічних антитіл до грипу птиць і двічі отримували негативний результат. Схема імунізації. Імунізацію проводять шляхом внутрішньом'язового введення вірусутримуючого матеріалу у дозі 0,5см 3 з ревакцинацією через 21 4 добу за аналогією. Через місяць після ревакцинації курей знекровлюють і отримують сироватку крові. Визначення активності та специфічності отриманих сироваток. Активність і специфічність сироваток визначають в реакції затримки гемаглютинації, яку ставлять мікрометодом, користуючись мікротитратором Такачі, і методом імуноферментного аналізу, користуючись системою Біочек або Айдекс. Порядок дослідження сироваток в РЗГА. Матеріали та реактиви: - фосфатно-сольовий буфер (ФСБ); - дистильована вода; - тест-система "АвіФлуТест H5N1" для виявлення антитіл до вірусу грипу підтипу H5N1; - піпетки мірні на 1,0-2,5см 3; - плексиглазові панелі або апарат Такачі із панелями V. Петлями на 0,05см 3. Постановка РЗГА проходить у декілька етапів: 1. Постановка реакції гемаглютинації (РГА). Для постановки РГА готують двократні розведення антигенів (Н1-Н14) від 1:2 до 1:4096. Для цього в усі лунки планшету з V-подібною формою дна розливають ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У першу лунку вносять рівний об'єм антигену, трьохкратно пипетують і переносять по 0,025см 3 у другу лунку і т.д. Із останньої лунки рідину, що титрується видаляють у дезрозчин. Після цього в кожну лунку вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3, а потім 1% суспензію еритроцитів курей в об'ємі 0,025см 3. планшет обережно струшують і залишають на 20-30 хвилин при кімнатній температурі (20-25°С). Облік реакції: Проводять по наявності гемаглютинації (парасольки) або її відсутності (ґудзика). За титр антигену приймають його найбільше розведення, в якому чітко виражена гемаглютинація (осідання еритроцитів у вигляді "парасольки"). Титр гемаглютинуючої активності не повинен бути нижче 1:32. 2. Приготування робочої дози антигенів (4 ГАО): Робочу доз у антигену готують з урахуванням активності антигену (титру) визначеному в РГ А. Для цього антиген розводять ФСБ у стільки разів, скільки одержують поділенням його титру на 4. Наприклад, якщо титр антигену визначений у РГА, становить 1:128, для реакції його беруть у розведенні 1:32 (128:4=32). Робочу дозу антиген у го тують безпосередньо в день постановки реакції з обов'язковим її контролем (4 ГАО). Для цього у 4 лунки планшета вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У першу лунку додають рівний об'єм робочого розведення антигену (4 ГАО) і після трикратного піпетування 0,025см 3 переносять у другу, третю лунку, а з четвертої видаляють після піпетування 0,025см 3 рідини в дезінфікуючий розчин. Після цього в кожну лунку додають 1 % суспензію еритроцитів курей в об'ємі 0,025 см 3. При правильному визначенні робочої дози антигену у 1 і 2 лунку, які містять 2 і 1 ГАО, відповідно, повинна бути повна аглютинація еритроцитів (осад у вигляді 5 31027 "парасольки"). У третій та четвертій лунках аглютинація повинна бути відсутня (осад має вигляд "ґудзика"). 3. Постановка РЗГА: В усі лунки V-подібного планшета вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У перші лунки додають рівний об'єм піддослідних сироваток, трьохкратно пипетують і роблять послідовні двократні розведення (від 1:2 до 1:4096). Далі в усі лунки планшета вносять антиген у робочому розведенні в об'ємі 0,025см 3 та витримують при кімнатній температурі 20°С протягом 40 хвилин, після чого додають 1% суспензію еритроцитів курей у об'ємі 0,025см 3. Планшет обережно струшують і для осадження еритроцитів залишають на 20-30 хвилин при кімнатній температурі (20-25°С), після чого проводять облік реакції. Одночасно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну аглютинацію (1% суспензія еритроцитів + ФСБ у рівних об'ємах по 0,025см 3). Аглютинація повинна бути відсутня. Облік реакції: Результат дослідження є позитивним, якщо титр антитіл у сироватці крові становить 3,0log (1:8) і вище. Порядок дослідження сироваток методом імуноферментного аналізу(ІФА). Використовують набір для визначення антитіл до вірусу грипу птиць виробництва Всеросійського науково-дослідного інституту захисту тварин. Суть методу полягає у виявленні комплексу антигенантитіло, сорбованого на поверхні лунок полістеролового планшету. Специфічний комплекс антиген-антитіло взаємодіє із антивидовим імунопероксидазним кон'югатом проти IgG курей та викликає розклад субстрату, фарбуючи вміст лунок планшету. Сироватки досліджують згідно Настанови по застосуванню набору для визначення антитіл до вірусу грипу птиць. Облік результатів аналізу проводять через 10-15 хвилин після внесення субстрату візуально за інтенсивністю фарбування вмісту лунок планшету та інструментально, користуючись системою Біочек або Айдекс, шляхом оцінки значень оптичної густини досліджуваних та контрольних сироваток. Кінцевим розведенням досліджуваної сироватки вважають останнє її розведення, у якому оптична густина перебільшувала негативний контроль у 2,0-2,1 рази. При дослідженні позитивних сироваток крові методом імуноферментного аналізу встановлено, що величина оптичної густини перебільшує оптичну густин у негативних контрольних сироваток у два рази. Так, оптична густина досліджуваних сироваток становить 2,5-3,1. Встановлено граничний титр досліджуваних сироваток 1:800. При отриманні сироватки у титрах 1:128-1:256 і вище в РЗГА та з оптичною густиною відносно нормальних сироваток не менше 2,5 і граничним титром не менше 1:800 в імуноферментному аналізі, сироватки вважають високоактивними, птицю знекровлюють з подальшим відокремленням сироватки і використанням для контролю серологічних реакцій. 6 Літературні джерела, прийняті до уваги при експертизі. 1. Бабкін М.В., Буз ун A.I., Стегній Б.Т., Герілович А.П. Депонування штаму "А (курка) Сиваш/02/05(Н5М1) " вірусу пташиного грипу. // Міжвід. тематич. Збірник. Ветеринарна медицина 2006. - №87. - с.31-34. 2. Белявцева О.А. Вивчення антитілоутворення до вірусу інфекційної бур сальної хвороби в організмі великої рогатої худоби. // Ветеринарна медицина України. - 1999 №2, с.18-19. 3. Белявцева О.А. Патент на корисну модель №21147 МПК 61К39/00. Спосіб отримання позитивної контрольної сироватки до вірусу інфекційного бронхіту к урей. 15.03.7 Бюл №3. 4. Вербицький П.І. Удосконалення заходів боротьби і профілактики інфекційної бурсальної хвороби в сучасних умовах ведення птахівництва України. Автореф. дис. на здоб. н.с. канд. вет. наук. - Х. - 2000, с.18. 5. Стегній Б.Т., Бісюк І.Ю., Музика Д.В., Головко А.Т., Гадзевич Д.Б., Бузун A.I., Коваленко Л.В., Стегній М.Ю., Рула О.М., Майорова К.Ф., Болдирєв А.Д., Білявцева О.А. Антигенні властивості інактивованої емульсованої вакцини проти високопатогенного грипу птиці "АвіФлуВак" // Міжвід. тематич. Збірник. Ветеринарна медицина. 2006. - №87. - с.211-217. 6. Патент на корисну модель №20245. Штам вірусу грипу "А (курка) Сиваш/02/05(Н5N1)" для виготовлення біопрепаратів проти пташиного грипу. Стегній Б.Т., Бузун A.I., Музика Д.В., Бабкін М.В., Бісюк І.Ю., Стегній М.Ю., Майорова К.Ф., Білявцева О.А. 7. Сюрин В.Н., А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина Вирусные болезни птиц. ВНИТИБП, М., 1998, с.183-196. 8. Singh, T.J. Kim, D.N. Tripathy - Re-emerged fowl pox: evaluation of isolation of isolates from vaccinated flocks. // Avian Pathology - 2000-29, 449445. 9. Sreenivasa М. Rao, G. Dhinakar Raj, and B. Murali Manohar / An in vitro and in vi vo evaluation of the virulence of Newcastle disease virus and vaccines for the chicken reproductive tract/ Avian Pathology (2002), 31, 507-513. 10. Wright H., En-Min Zhou. Development in international standartization. // Vet. Smmunol. And immunopathol. - 1999. - 72 №1-2 - p.243-248. 11. Singh, T.J. Kim, D.N. Tripathy - Re-emergag fowlpox: evaluation of isolation of isolates from vaccinated flocks. // Avian Pathology - 2000-29, 449445.