Спосіб виготовлення поживного середовища для культивування мікроорганізмів

Спосіб виготовлення поживного середовища для культивування мікроорганізмів, що передбачає використання як живильної основи білкового гідролізату, який відрізняється тим, що основною сировиною є гепаринізована кров великої рогатої худоби та процес протеолізу здійснюють за допомогою ферментів плазмолізованих дріжджів у термостаті за температури 60°С впродовж 48 годин. (19) (21) u200708581 (22) 26.07.2007 (24) 26.05.2008 (46) 26.05.2008, Бюл.№ 10, 2008 р. (72) РУДЕНКО АНДРІЙ АНАТОЛІЙОВИЧ, UA, РУДЕНКО ПАВЛО АНАТОЛІЙОВИЧ, UA, САДОВА СВІТЛАНА СЕРГІЇВНА, UA (73) ЛУГАНСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA 3 Недоліком даної корисної моделі є те, що зазначене середовище не вміщує достатню кількість ростових факторів, при цьому казеїн не є оптимальним продуктом для виготовлення поживних середовищ; коефіцієнт його використання в цьому випадку складає менш ніж 30%. В той же час, відомий спосіб виготовлення поживного середовища через тривалість ферментативного гідролізу впродовж 10-14 днів передбачає значні матеріальні витрати на здійснення процесу. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити процес одержання поживного середовища для культивування виробничих штамів пастерел, стафілококів, ешерихій та бордетел шляхом використання доступної, дешевої білкової основи та оптимізування режиму гідролізу. корисної моделі вирішується тим, що Задача при виготовленні поживного середовища в якості сировини використовується гепарінізована кров великої рогатої худоби та процес аутолізу здійснюється за допомогою протеолітичних ферментів плазмолізованих дріжджів у термостаті за температури 60°С впродовж 48 годин. Спосіб виготовлення поживного середовища для культивування вакцинних штамів пастерел, стафілококів, ешеріхій та бордетел складається з наступних технологічних прийомів: 1) Одержання основної сировини, в якості якої виступає гепарінізована кров великої рогатої худоби з вмістом гемоглобіну і загального білку відповідно не менш, ніж 120 та 65г/л; 2) Руйнування клітин крові проводять шляхом трьохразового заморожування-відтаювання; 3) Процес гідролізу здійснюється під дією внутрішньоклітинних ферментів дріжджів. Для руйнування мікробної клітини дріжджі плазмолізують спирто-ефірною сумішшю (на 1л етанолу додають 40мл ефіру для наркозу). Плазмоліз проводять протягом 15 хвилин за температури 21±4°С. 4) Плазмолізовані дріжджі об'єднують з гемолізованою кров'ю у співвідношенні 1:1 і піддають гідролізу в термостаті за температури 60°С впродовж 48 годин, після чого в суміш додають 1л дистильованої води. 5) Насиченим водяним розчином NaHCO3 корегують рН в суспензії до 8,0, після чого гідролізат піддають дворазовому фільтруванню і автоклавуванню за температури 121°С; 6) Для здійснення культивування вакцинних штамів мікроорганізмів використовують рідкі і щільні варіанти поживних середовищ, через це рецептурні прописи мають наступний вигляд: а) склад рідкого живильного середовища: Поживний бульйон сухий 15,0г Дріжджовий аутолізат крові 100см3 Вода дистильована 900см3 б) склад твердого живильного середовища: Поживний агар сухий 25,0г Дріжджовий аутолізат крові 100см3 Вода дистильована 900см3 Інгредієнти ретельно перемішують, нагрівають до повного розчинення компонентів, доводять рН до 7,2-7,4, фільтрують у гарячому стані через ватно-марлевий фільтр і розливають у флакони, 32523 4 матрасні колби, бутлі в кількостях, необхідних для накопичення біомаси виробничих штамів бактерій. Стерилізують в автоклаві за температури 121±1°С 15 хвилин. Запропоноване поживне середовище і спосіб його виготовлення широко випробувані в дослідницько-виробничій практиці кафедри якості і безпеки продукції АПК факультету ветеринарної медицини Луганського національного аграрного університету. Вперше з виробничих штамів пастерел, стафілококів, ешеріхій та бордетел, які культивували на поживних середовищах, що вміщували дріжджований аутолізат крові, виготовлені експериментально-виробничі серії вакцини інактивованої проти пастерельозу кроликів, асоційованої інактивованої вакцини проти інфекційних пневмоентеритів кроленят, які за всіма контрольними тестами відповідали вимогам інструкцій і технічних умов. Встановлена висока якість і економічність поживних середовищ на основі дріжджованого аутолізату крові. Запропоноване поживне середовище вміщує всі необхідні живильні інгредієнти для життєдіяльності вакцинних штамів мікроорганізмів. Приклад 1. Виготовлення дріжджового аутолізату крові. Використовували гепарінізовану кров великої рогатої худоби з вмістом гемоглобіну і загального білку відповідно не менш, ніж 120 та 65г/л. Руйнування клітин крові проводили шляхом трьохразового заморожування-відтаювання. Дріжджі плазмолізували спирто-ефірною сумішшю (на 1л етанолу додавали 40мл ефіру для наркозу). Плазмоліз проводили протягом 15 хвилин за температури 21±4°С. Плазмолізовані дріжджі об'єднували з гемолізованою кров'ю у співвідношенні 1:1 і піддавали гідролізу в термостаті за температури 60°С впродовж 48 годин, після чого в суміш додавали 1 л дистильованої води. Корегували рН в суспензії до 8,0, далі гідролізат піддавали дворазовому фільтруванню й автоклавуванню за температури 121°С; Приклад 2. Конструювання поживних середовищ на основі дріжджового аутолізату крові. Для виготовлення рідкого поживного середовища використовували наступні інгредієнти: поживний бульйон сухий - 15,0г; дріжджований аутолізат крові - 100см3; вода дистильована 900см3. Всі компоненти ретельно перемішували, нагрівали до повного розчинення, перевіряли рН 7,2-7,4, фільтрували у гарячому стані через ватномарлевий фільтр і розливали у пробірки, флакони. Стерилізували в автоклаві за (121±1)°С 15 хвилин і проводили контроль стерильності у термостаті за температури 37,0-38,0°С на протязі 24 годин. При конструюванні щільного поживного середовища використовували наступну рецептурну композицію, а саме: поживний агар сухий - 25,0г; дріжджовий аутолізат крові - 100см3; вода дистильована - 900см3. Інгредієнти ретельно перемішували, нагрівали до повного розчинення, перевіряли рН 7,2-7,4, фільтрували у, гарячому стані через ватно-марлевий фільтр і розливали у матрасні колби. Стерилізували в автоклаві за температурою 121±1°С 15 хвилин. Після чого 5 32523 матрасні колби з середовищем клали горизонтально і вичікували 60-90 хвилин до повного затвердіння агару. Далі колби перевертали агаром догори й проводили контроль стерильності у термостаті 37,0-38,0°С впродовж 24 годин. Приклад 3. Культивування вакцинних штамів пастерел, стафілококів, ешеріхій та бордетел. Для виготовлення дослідно-виробничих серій вакцин накопичення бактеріальної маси пастерел штамів № 127, № 99, стафілококів штаму № 115, ешеріхій штаму № 88 та бордетел штаму № 129 проводили на МЛА з додаванням 10,0% дріжджового аутолізату крові у 1,5л матрацних колбах. Матричні культури епізоотичних штамів вирощували у пробірках з 9,0см3 МПБ за температури 37,5±0,5°С на протязі 20,0±2,0 годин із розрахунку 1 пробірка на матрас із 250,0см3 твердого поживного середовища. Вирослими культурами бактерій засівали матраси, які після Комп’ютерна верстка Н. Лисенко 6 висіву витримували агаром вниз за кімнатної температури 20-30 хвилин, а потім перевертали агаром догори розміщували в термостаті і вирощували за температури 37,5±0,5°С впродовж 18-22 годин в залежності від накопичення біомаси. Після візуальної перевірки чистоти росту культур, робили мазки, які фіксували на полум'ї спиртівки і фарбували за Грамом. Приклад 4. Визначення накопичення біомаси вакцинних штамів бактерій на середовищі, що заявляється. Експериментальне визначено, що найбільший врожай бактеріальних клітин у матрацних колбах було отримано при вирощуванні культур Е. соlі №88 (4,1´1012) та S. aureus №115 (3,6´1012), декілька слабкіше накопичувалися ізоляти P. multocida № 99 (2,9´1012), P. multocida № 127 (2,3´1012) та В. bronchistptica №129 (2,1´1012 мікробних клітин за оптичним стандартом мутності). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601