Спосіб оцінки процесу ліпідної пероксидації в тромбоцитах

Спосіб оцінки процесу ліпідної пероксидації в тромбоцитах шляхом газохроматографічного аналізу ліпідних показників крові, який відрізняється тим, що проводять газохроматографічний аналіз показників загальних ліпідів тромбоцитів і за їх кількісним вмістом визначають інтенсивність ліпідної пероксидації. (19) (21) 99031690 (22) 25.03.1999 (24) 15.02.2001 (33) UA (46) 15.02.2001, Бюл. № 1, 2001 р. (72) Захараш Михайло Петрович, Іванова Надія Володимирівна, Брюзгіна Тетяна Семенівна, Бережний Анатолій Борисович 33711 Газохроматографічний аналіз спектра жирих кислот ліпідів і рівня вільного холестерину в тромбоцитах здійснюють окремо на газових хроматографах серії Цвет-500 з полум’яноіонізаційним детектором в ізотермічному режимі при таких умовах: для визначення рівня холестерину використовують скляну колонку (розмір 1 м х 0,3 см), заповнену фазою 5% SE-30 на хроматоні N-A\H-HМФS (зернення 0,125-0,160 мм), температура колонки 270оС випарювача - 290оС, витрати азоту і водню - 45 мл/хв, швидкість діаграмної стрічки - 240 мм/год, чутливість шкали регулятора 10-А, об'єм введеної проби - 2 мкл, тривалість аналізу - 5хв. Кількісну оцінку вільного холестерину здійснюють за методом абсолютного калібрування за допомогою стандартного розчину холестерину з концентрацією 1 мг/мл. Похибка визначення - 10%. Для визначення спектру жирних кислот ліпідів використовують скляну колонку (розмір 3 м х 0,3 см), заповнену фазою 5% ПЕГС на хроматоні N-A\H-HMФS (зернення 0,125-0,160 мм), температура колонки - 190оС, температура випарювача-250оС, витрати азоту і водню 35 мл/хв, чутливість шкали - 10-а, об'єм ввідної проби - 5 мл, тривалість аналізу - 20 хв. Кількісну оцінку спектру жирних кислот ліпідів проводять за методом нормування площі, визначення вмісту ПНЖК ліпідів у плазмі крові, еритроцитах і тромбоцитах наведені у табл. 1. З табл. 1 видно, що певні зміни двох ліпідних показників спостерігаються тільки в тромбоцитах, виділених з крові хворих. Підвищення інформативності аналізу, скорочення часу підготовки проб спрощення способу досягається шляхом вибору оптимального біологічного об'єкта для вивчення ліпідних показників. Приклади конкретного виконання способу Біологічні проби (плазма у кількості 0,5 мл, суспензія еритроцитів - 1,5 мл, суспензія тромбоцитів в кількості 2 мл) піддають екстракції двічі сумішшю хлороформ-метанолу (в співвідношенні 2:1) в кількості 5 мл. Екстракцію ліпідів проводять протягом 30 хвилин на холоді (4оС), для кращого розподілу фаз наприкінці екстрагування додають 1 мл 0,74%ний KCL. Об'єднані хлороформні екстрати (нижній шар) при розподілі фаз відбирають піпеткою Пастера, концентрують випарюванням насухо в потоці азоту при температурі 45оC на водяній бані. До сухого залишку ліпідів додають 3 мл 1%ного розчину сірчаної кислоти в метанолі, переносять розчин в скляну ампулу місткістю 5 мл, запаюють і інкубують на водяній бані при температурі 85оC протягом 30 хвилин. Після інкубації пробу охолоджують і проводять дворазову екстракцію метильованих продуктів гідролізу ліпидів 3 мл гексан-ефірної суміші (в співвідношенні 1:1). Для швидкого розподілу фаз додають по 1 мл дистильованої води і збовтують верхній шар при фаз. Об'єднані гексан-ефірні екстрати концентру ють насухо випаровуванням в потоці азоту при температурі 45оС на водяній бані. Сухий залишок розчиняють в 5 мкл гексан-ефірної суміші і вводять пробу у випаровувач хроматографа. Газохроматаграфічний аналіз спектру жирних кислот ліпідів і рівня холестерину в біологічних пробах здійснюють окремо на газових хроматографах серії Цвет-5000 з пoлум’яно-іонізаційним детектором в ізотермічному режимі за таких умов: для визначення рівня холестерину використовують скляну колонкy (розмір 1 м х 0,3 см), заповнену фазою 5% 8Е-30 на хроматоні (зернення 0,1250,160 мм), температура колонки 270оC випарювача - 290оС, витрати азоту і водню - 45 мл/хв, швидкість діаграмної стрічки - 240 мм/год, чутливість шкали регулятора - 10-а, об'єм введеної проби 2 мкл, тривалість аналізу - 5 хв. Кількісну оцінку вільного холестерину здійснюють за методом абсолютного калібрування за допомогою стандартного розчину холестерину з концентрацією 1 мг/мл. Похибка визначення - 10%. Для визначення спектру жирних кислот ліпідів використовують скляну колонку (розмір 3 м х 0,3 см), заповнену фазою 5% ПЕГС на хроматоні (зернення 0,125-0,160 мм), температура колонки 190оС, температура на хроматоні (зернення 0,1250,160 мм), температура колонки випарювача 250оС, витрати азоту і водню - 35 мл/хв, повітря – 200 мл/хв, швидкість діаграмної стрічки 240 мм/год, чутливість шкали - 10-а, об'єм ввідної проби - 5 мл, тривалість аналізу – 20 хв. Кількісну оцінку спектру жирних кислот ліпідів проводять за методом нормування площі, визначення частки кислот в %. Похибка визначення - 10%. Результати газохроматографічного аналізу наведені в табл. 2. Всі хворі знаходилися на стаціонарному лікуванні в кардіологічному і терапевтичному відділеннях госпіталю військово-медичного управління СБ України (мед. книги № 6579, історія хвороби №№ 809, 807, 810, 1073, 1071, 1072). Таким чином, зниження рівня суми ПНЖК, яке свідчить про активацію процесу ліпопероксидації, в тромбоцитах визначається у 85% випадках, в еритроцитах - у 42% випадках, в плазмі - у 12%. Наведений спосіб має наступні переваги перед відомим: доступний і легко виконується; відрізняється більшою інформативністю аналізу; дозволяє скоротити час на стадії підготовки проб; є ефективним при серійних дослідженнях в клінічних умовах. Джерела інформації 1. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972. - 259 с. 2. Бурлаков Е.Б, Терехова С.Ф. Холестерин в реакции свободнорадикального окисления // Свободнорадикальное окисление липидов в норме и при патологии. - М., 1976. - С. 22. 3. Брюзгина Т.С., Кравченко Э.Я., Дониш А.В. Газохроматографическое определение жирных кислот фосфолипидов и свободного холестерина в одной биологической пробе // Лаб. дело. - 1991. № 9. – С. 18–19. 2 33711 4. Балуда В.П., Баркаган З.С., Гольдберг Б.Л., Кузник Б.И. Лабораторные методы исследования системы гемостаза. – Томск, 1980. - 309 с. 5. Марков Г.М., Атрохов В.В. Влияние пищевой линолевой кислоты на агрегацию тромбоцитов, жирнокислотный состав и синтез фосфолипидов и простагландинов у крыс // Вопросы мед. химии. 1988 - № 4. - С. 37-41. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3