Спосіб газорідинної хроматографії жовчних кислот

і. Спосіб газорідинної хроматографії жовчних кислот (ЖBK), який включає розділення плазми на фракції, гідроліз білкової фракції, очищення, дериватизацію ЖВК шляхом метилування та газорідинний аналіз проби, що відрізняється тим, що у процесі розділення плазми крові використовують 33725 Здіснення очищення ЖВК перед дериватизацією сприяє підвищенню якості розділення ЖВК. Проведення ГРХ з твердим носієм - хроматоном з 3%-ною НФ OV-225 сприяє зменшенню витрат хімічних реактивів та тривалості аналізу. Таким чином, заявлюваний спосіб спрямовано на спрощення підготовчих операцій та проведення ГРХ. Дослідження за заявлюваним способом проведені у відділі біохімії Інституту терапії АМН України на 30 пробах. Дослідження дозволили встановити оптимальний режим виділення та аналізу ЖВК. Відрізняючі ознаки відповідають критерію "новизна" та вимогам винахідницького рівня. Використання цього способу у медико-біологічній практиці дозволяє спростити спосіб ГРХ, зменшити витрати хімічних реактивів та тривалість дослідження, а також розширити галузь застосування вихідної проби для аналізу. Запропонований спосіб здійснюють таким чином. 1. Для розділення плазми крові на фракції добавляють до плазми або до проби сироватці розчин Фолча у кількості 0,5-1 мл з послідуючими перемішуванням та центрифугуванням. 2. Зливають верхній та нижній шари із утворюваного трьохшарового розчину. 3. Проводять гідроліз середнього білкового шару розчину за п. 2 шляхом добавлення лугу NaOH у кількості 10 мл з послідуючим нагрівом на піщаній або водяній бані протягом 20 хвилин. 4. Охолоджують розчин та нейтралізують його шляхом добавлення 12%-ного розчину HCl до нейтральної реакції. 5. Екстрагують жовчні кислоти шляхом добавляння 10 мл етилацету, упарювання досуха. 6. Для очищення проби розчиняють одержаний сухий екстрагований залишок у співвідношенні 1:1 та пропускають через сорбент - сефадекс. 7. Упарювають розчин досуха та здійснюють дериватизацію ЖВК шляхом добавляння 1%-ної сіркової кислоти у метанолі і 0,1 мл триметілхлорсилана при температурі 80°С протягом 30 хвилин. 8. Охолоджують розчин до кімнатної температури, додають дистильовану воду у кількості 3 мл, добувають ЖВК шляхом добавлення суміші - гексан-хлороформ у співвідношенні 1:1 у кількості 5 мл та упарюють досуха. 9. Розчиняють сухий залишок екстракту у гексані у кількості 0,1-0,5 мл. 10. Проводять газорідинний хроматографічний аналіз ЖВК за допомогою полуменевого іонізаційного детектора (ПИД) та використовують твердий носій - хроматон з 3%-ною НФ OV-225 за режимом нагрівання: колонки - 200°С, випарника - 230°С, детектора - 250°С при витраті газа-носія 50 мл за хвилину. Тривалість аналізу - 10 хвилин. Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується прикладом. Приклад До плазми крові у кількості 1 мл добавляють розчин Фолча (0,5 мл), перемішують та центрифугують. Зливають верхній та нижній шари розчину і проводять гідроліз середнього білкового шару шляхом добавлення лугу NaOH у кількості 10 мл з послідуючим нагрівом на водяній бані протягом 20 хвилин. Розчин охолоджують та нейтралізують шляхом добавлення 12%-ного розчину NaCl до нейтральної реакції. Для екстрагування жовчних кислот добавляють 10 мл етиацету та упарюють досуха. Очищають пробу сорбентом - сефадексом у співвідношенні 1:1. Розчин упарюють досуха, здійснюють дериватизацію шляхом добавляння 1%-ної сіркової кислоти у метанолі та 0,1 мл триметілхлорсилана при температурі 80°С протягом 30 хвилин. Далі розчин охолоджують, додають дистильовану воду у кількості 3°мл, добавляють суміш із гексана-хлороформа у співвідношенні 1:1 у кількості 5 мл та знову упарюють досуха. Сухий залишок екстракту розчиняють у гексані (0,1 мл). Проводять газорідинний хроматографічний аналіз ЖВК за режимом за п. 10. У таблиці показані результати газорідинного хроматографічного аналізу за заявлюваним способом. Абсолютна похибка не більше 6%. Висновок. Таким чином, заявлюваний спосіб відрізняється певністю та малою тривалістю дослідження. Кількість одержаних жовчних кислот, мкг Абсолютна похибка, % Відносна похибка, % 1. Холева 4,0-0,06 5,0 11,0 2. Хенодезоксихолева 4,6-0,09 4,0 8,0 Види жовчних кислот n=8 3. Літохолева 4,6-0.07 5,0 11,0 4. Дезоксихолева 4,2-0,085 6,0 12,5 2 33725 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3