Спосіб діагностики днк-утримуючих вірусів

Спосіб діагностики ДНК-утримуючих вірусів, що включає відділення частини тканини організму, 3 35987 93°С - 1хв, відпалювання 35°С - 1хв, синтез 72°С 1хв - 5 циклів; денатурація 93°С - 0,5хв, відпалювання 35°С - 0,5хв, синтез 72°С - 0,5хв - 40 циклів. Термінальну стадію синтезу проводили при 72°С 3хв. Продукти ампліфікації розділяли методом електрофорезу в 1,8% агарозному гелі. Через невелику довжину праймера фрагментів ДНК звичайно багато. Найбільше, що зустрічають часто фрагменти, вірусної ДНК (консервативні ділянки) придатні для діагностики даного вірусу Приклад 1 Для діагностики активного вірусу ядерного поліедрозу непарного шовкопряда використали вірусні препарати з Киргизії, Росії, Китаю й України. Екстракцію тотальної ДНК проводили з використанням комплекту "Днк-сорб-А" варіант 100 фірми Амплисенс (по інструкції). RAPD-PCR проводили в реакційній суміші обсягом 29мкл на термоциклері "Терцик" (Днк-технологія, Росія) з використанням реактивів для полімеразної ланцюгової реакції "Амплисенс-200-1" (Амплисенс, Москва). Реакційна суміш обсягом 29мкл містила: 5-х PCR-буфер 5мкл; MgSO4 , 50 Mm - 1,5мкл; Н2О Milli - 3мкл; dNTP-mix - 2,5мкл, 2Mm; Taq-полімераза, 5ед/мкл - 0,5мкл; мінеральне масло - 10,5мкл; праймер, А260 10ОЕ/мол - 1мкл; Т-буфер з дослідженою ДНК - 5мкл. RAPD-PCR проводили в режимі: денатурація 93°С - 1хв, відпалювання 35°С - 1хв, синтез 72°С - 1хв - 5 циклів; денатурація 93°С - 0,5хв, відпалювання 35°С - 0,5хв, синтез 72°С - 0,5хв - 40 циклів. Термінальну стадію синтезу проводили при 72°С - 3хв. Продукти ампліфікації розділяли методом електрофореза в 1,8% агарозному гелі. Для проведення RAPD-PCR використали праймер ОРА-08 (GTGACGTAGG). У ході RAPD-PCR с використанням праймера ОРА-08 були отримані продукти ампліфікації ДНК вірусів з різних вірусних препаратів (Фіг.1). Отримані набори фрагментів ДНК вірусу можна умовно розділити на три зони: 01, 02 і 03 довжиною близько 150, 250 і 400п.н., які присутні у всіх трьох вірусних препаратах. Продукти ампліфікації мають гарну відтворюваність і їх можна використати як маркери ДНК вірусу ядерного полиедроза непарного шовкопряда. 1 - з України; 2 - з Китаю (1); 3 - з Росії; 4 - з Китаю (2); 5 - Киргизії; 6 - маркер молекулярних ваг ДНК від 200 до 1000п.о. із кроком в 100п.о.; 00, 01, 02, 03 - умовні зони продуктів ампліфікації вірусної ДНК. 4 Приклад 2 Для діагностики латентного вірусу ядерного поліедроза використали яйця непарного шовкопряда. Екстракцію тотальної ДНК проводили з використанням комплекту "Днк-сорб-А" варіант 100 фірми Амплисенс (по інструкції). RAPD-PCR проводили в реакційній суміші обсягом 29мкл на термоциклері "Терцик" (Днк-технологія, Росія) з використанням реактивів для полимеразної ланцюгової реакції "Амплисенс-200-1" (Амплисенс, Москва). Реакційна суміш обсягом 29мкл містила: 5-х PCRбуфер - 5мкл; MgSO4, 50Mm - 1,5мкл; H2О Milli 3мкл; dNTP-mix - 2,5мкл, 2Mm; Taq-полимераза, 5од/мкл - 0,5мкл; мінеральне масло - 10,5мкл; праймер, А260 10ОЕ/мол - 1мкл; Т-буфер з дослідженою ДНК - 5мкл. RAPD-PCR проводили в режимі: денатурація 93°С - 1хв, відпалювання 35°С 1хв, синтез 72°С - 1хв - 5 циклів; денатурація 93°С - 0,5хв, відпалювання 35°С - 0,5хв, синтез 72°С 0,5хв - 40 циклів. Термінальну стадію синтезу проводили при 72°С - 3хв. Продукти ампліфікації розділяли методом електрофореза в 1,8% агарозному гелі. Для проведення RAPD-PCR використали праймер ОРА-08 (GTGACGTAGG). У ході RAPD-PCR з використанням праймера ОРА-08 були отримані продукти ампліфікації ДНК вірусів, що перебувають на поверхні й усередині яєць, що містять умовні зони 01, 02, 03 (Фіг.2.). 1.1, 2.1, 3.1, 4.1, 5.1, 6.1, 7.1 - досліджувалася поверхня яєць на наявність вірусної ДНК; 1.2, 2.2, 3.2, 4.2, 5.2, 6.2, 7.2 - досліджувався вміст яєць на наявність вірусної ДНК; М - маркер молекулярних ваг ДНК від 200 до 1000п.н. із кроком в 100п.н. Заявлений спосіб відрізняється тим, що замість двох специфічних праймерів використається один випадковий. Спосіб дозволяє діагностувати віруси ядерного поліедроза комах, послідовність генома яким не встановлена, дозволяє діагностувати вірус у ти х випадках, коли вірусна ДНК частково зруйнувалася або змінилася. Спосіб реалізується при наявності всіх консервативних фрагментів вірусної ДНК, при наявності їх окремо або в будь-якім сполученні й будуть маркірувати наявність вірусу. Запропонований спосіб діагностики вірусу в організму має точність і здатний виявити присутність ДНК вірусу або її фрагментів на різних етапах розвитку вірусної інфекції: від окультної й латентної до активної форми. 5 Комп’ютерна в ерстка А. Рябко 35987 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601