Спосіб визначення активності b-галактозидази в паренхімі нирки

Спосіб визначення активності bгалактозидази в паренхімі нирки, який включає 3 36030 Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення активності b -галактозидази в паренхіми нирки, який включає додавання до нативного біологічного матеріалу цитратного буфер у та розчину субстрату, інкубацію реакційної суміші при 37°С протягом 30 хвилин, припинення ферментативної реакції додаванням розчину вуглекислого натрію, визначення оптичної щільності отриманої проби фотоколориметричним методом, згідно з винаходом, об'єктом для дослідження є 2,5% розчин гомогенату коркового шару паренхіми нирки, який розводять у 2 рази цитратним буфером, та обчислюють отриманий результат з урахуванням кількості мг білка у біологічному матеріалі. Спосіб визначення активності bгалактозидази в паренхімі нирки виконують наступним чином: з отриманої наважки, наприклад, 1г сирої тканини коркового шару паренхіми нирки, готують 25% розчин гомогенату, для чого тканину ретельно подрібнюють і розтирають скляним пестиком в скляному гомогенізаторі, розміщеному у посудині із льодом, додають холодний (0-2°С) 0,9% фізіологічний розчин в об'ємі 1:3, тобто на 1 наважку тканини нирки додають 3мл 0,9% фізіологічного розчину. Все ретельно перемішують. Важливо, що всі процедури з наважкою тканини коркового шару нирки виконують швидко та обов'язково на льоду. Одержаний в такий спосіб 25% розчин гомогенату тканини нирки далі розводять у 10 разів фізіологічним розчином, потім ретельно перемішують та центрифугують в центрифужній пробірці при 3000 обертах за хвилину впродовж 10 хвилин для осадження залишків тканини. Надосадову рідину, що являє собою 2,5% розчин гомогенату коркового шару паренхіми нирки, зливають у окрему пробірку, розводять у 2 рази 0,1М цитратним буфером та ретельно струшують. Надалі в пробірку беруть 0,2мл цього гомогенату і додають до них 0,3мл 0,1М цитратного буферу рН 4,15 та 0,2мл субстрату, який включає 10мМ розчину 2нітрофеніл- b -D-галактопіранозиду у 0,1М цитратному буфері рН 4,15. Проби інкубують 30 хвилин при 37°С, потім реакцію зупиняють додаванням 0,8мл 0,1М розчину вуглекислого натрію. Оптичну щільність пара-нітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, вимірюють на фотоелектроколориметрі при 400нм в кюветах з товщиною шару 3мм проти контрольної проби, в яку розчин субстрату вносять після припинення ферментативної реакції. Кількість паранітрофенолу, що утворився в результаті ферментативної реакції, визначають за калібрувальною кривою. Ферментативну активність b -галактозидази в паренхімі нирки з урахуванням ступеню розведення біоматеріалу розраховують у відносних одиницях - у мкмолях пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1 години, із розрахунку на 1мг білка у біологічному матеріалі. Вміст білка визначають біуретовим методом. Необхідність приготування та використання гомогенату паренхіми нирки досить низької концентрації - 2,5% розчину, а потім додаткового його розведення в два рази викликана високою активні 4 стю b -галактозидази в корковому шарі паренхіми нирки. Крім того, гомогенат тканини нирки в високій концентрації є густою та малопрозорою суспензією, і використання її в такому стані впливає на прозорість реакційної суміші, що, в свою чергу, може привести до отримання хибних результатів щодо активності ферменту через збільшення оптичної густини реакційної суміші. Розведення біоматеріалу значно зменшує також вплив на активність ферменту інгібіторів та активаторів, які можуть бути в концентрованому гомогенаті, що також збільшує вірогідність отримання достовірних результатів дослідження. Обчислення активності ферменту з урахуванням кількості мг білка у біологічному матеріалі надає отриманим результатам більшої об'єктивності та більшої інформативності в оцінці функціонального стану паренхіми нирки. Практичне використання способу, що заявляється, проведено в лабораторії біохімії та в лабораторії нейроурології ДУ "Інститут урології АМН України". Дослідження проведені на 12 здорових експериментальних тваринах - кроликах, статевозрілих самцях вагою у середньому 3,2±0,05кг. Результати дослідження рівнів активності b галактозидази в паренхімі нирки практично здорових тварин дорівнюють у середньому 0,24±0,028мкмолей пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1 год інкубації при 37,0° С із розрахунку на 1мг білка. Точність способу, тобто помилка у двох паралельних визначеннях, не перевищує ±5,7%. Наводимо приклад застосування запропонованого способу. Приклад. Із зразку тканини коркового шару паренхіми здорової нирки кролика №4 вагою 3250г, протокол від 18.01.08p., згідно запропонованого способу, готують 2,5% розчин гомогенату та визначають активність b -галактозидази, яка становила 0,29мкмолей пара-нітрофенолу, що утворився протягом 1год інкубації при 37,0°С із розрахунку на 1мг білка (мкмоль/год/мг білка). Спосіб, що заявляється, може бути використаним в експериментальних умовах для оцінки ефективності як медикаментозного, так і оперативного лікування нирки, дослідження особливостей метаболічних процесів за різних патологічних станів, які можуть бути змодельовані в паренхімі нирки при виконанні науково-дослідних робіт тощо, а також в умовах клініки для уточнення діагностики, можливого передбачення подальшого прогресування перебігу хвороби, поглибленого вивчення ступеня порушення функціонального стану паренхіми нирки за різних варіантів трансплантації нирки, після хірургічни х операцій, а також можливо в разі необхідності при дослідженні прижиттєвого біопсійного матеріалу. Таким чином, спосіб визначення активності b галактозидази в паренхімі нирки є точним, інформативним, нескладним у виконанні, добре відтворюваним, потребує невеликої кількості біологічного матеріалу, дає об'єктивну оцінку отриманих результатів за рахунок обчислення активності ферменту у відносних одиницях (на 1мг білка дослі 5 36030 джуваного розчину гомогенату), коефіцієнт варіабельності способу не перевищує ±5,7%. Джерела інформації, прийняті до уваги при експертизі: 1. Пат. №38591 A, UA, МПК7 , G 01 N 33/48. Спосіб диференційної діагностики гломерулонеф Комп’ютерна в ерстка І.Скворцов а 6 риту та пієлонефриту в стадії хронічної ниркової недостатності IV ступеня /Мигаль Л. Я., Нікуліна Г. Г., Баран Є. Я., Кіндій Т. В., Баран Є. Є.; ІУНАМНУ; №2000074557, 28.07.2000. Опубл. 15.05. 2001, Бюл. №4.- 4с. (прототип). Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601