Спосіб зберігання штамів збудника туляремії

Спосіб зберігання штамів збудника туляремії, що включає застосування елективного живильного середовища - FT-aгapy, який відрізняється тим, що спосіб здійснюють в два етапи: спочатку вирощують культуру на середовищі Мак-Коя, а одержану бактеріальну масу переносять на напіврідке ceредовище, яке готують з концентрацією FTaгapy 0,2-0,4%. (19) (21) u200807207 (22) 26.05.2008 (24) 10.12.2008 (46) 10.12.2008, Бюл.№ 23, 2008 р. (72) ЮРДАНОВА АЛЛА МИКОЛАЇВНА, UA, МАНЬКОВСЬКА Н АДІЯ МИКОЛАЇВНА, U A (73) УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ПРОТИЧУМНИЙ ІНСТИТУТ ІМ. І.І.МЕЧНИКОВА, UA 3 37712 невисоких концентрацій посівного матеріалу, більш швидка дисоціація культури та ймовірність контамінації сторонньою мікрофлорою. Задачею заявленого способу являється оптимізація умов зберігання живих мікроорганізмів збудника туляремії, при умові відповідності усіх характеристик штамів, протягом більш тривалого терміну, при менших затратах. Задача досягається тим, що зберігання проводять в два етапи: спочатку вирощують культуру на середовищі Мак-Коя, а потім одержану бакмасу переносять на напіврідке середовище з концентрацією FT-агарy 0,2-0,4%. При виборі альтернативного засобу збереження культур в умовах напіврідкого середовища, як аналога природних умов існування туляремійних бактерій (внутрішньоклітинний паразитизм), враховувалася потреба бактерій адгезуватися на часточках агару та рівномірно розподілятися в об'ємі середовища з використанням факторів росту і поживних субстратів FT-агарy. За таких умов знижується можливість проникнення в поживне середовище атмосферного кисню, що сприяє тривалому збереженню мікробів, без додаткового їх розмноження. Запропонований спосіб збереження музейних та промислових вакцинних штамів збудника туляремії реалізують наступним чином. 1. Готують 0,2-0,4% напіврідке середовище FT-агарy, для цього беруть 2-4г сухої основи на 1дм 3 дистильованої води. Глюкозо-вітамінна добавка, в яку входить глюкоза, вітамін В1, та кальцію пантотенат додають за схемою прототипу. Готове середовище розливають у стерильні пеніцилінові флакони по 3мл. 2. Культур у F.tularensis, попередньо вирощену на середовищі Мак-Коя (проміжний етап технології, який використовують лише для вирощування культури бактерій), вносять в об'ємі 0,1-0,5мл з концентрацією зависі 5-10млрд. м.к/мл (за оптичним стандартом мутності) у поживне напіврідке середовище, виготовлене за п.1, та закривають гумовими пробками. Зберігають при температурі 4°С протягом 12-14 місяців. Концентрація середовища менше 0,2% та більше 0,4% для зберігання культури призводить до значної дисоціації (утворення неімуногенних Rформ) та швидкого відмирання бактерій. Після закінчення терміну зберігання культури проводять плановий пасаж культури, що зберігається. Беруть 0,1мл суспензії з напіврідкого середовища та засівають на скошене жовткове середовище Мак-Коя або на тверде середовище FTагарy. Культивують за звичайних умов. Запропонований спосіб, у порівнянні з прототипом, обумовлює: 4 - використання нового ефективного поживного середовища для зберігання музейних та промислових культур зб удника туляремії; - подовження зберігання культур без обов'язкових пересівів на нове поживне середовище у 3-4 рази; - скорочення вартості жовткового середовища Мак-Коя у 8-10 разів, як проміжного етапу процессу зберігання. Приклад 1. 1. Виготовлено тверде жовткове середовище Мак-Коя у пробірках. 2. Приготування напіврідкого поживного середовища. Готували 0,2% напіврідке середовище FTагарy. Для цього брали 2г сухої основи на 1дм 3 дистильованої води. Стерилізували при 120°С впродовж 15 хвилин. Охолоджували до 50-45°С. Готували глюкозо-вітамінну добавку, стерилізували її при 110°С протягом 30 хвилин, охолоджували і додавали у підготовлене напіврідке середовище. Готове середовище розливали у стерильні пеніцилінові флакони по 3мл. 3. Вирощування культури F.tularensis на твердому жовтковому середовищі Мак-Коя. Середовище засіяли культурою туляремійного мікробу та вирощували 48 години при 37°С. Перший пасаж культури туляремійного мікробу змивали 0,9% фізіологічним розчином з поверхні твердого жовткового середовища Мак-Коя. 4. Одержану завись бактерій переносили на приготовлене напіврідке середовище. По 0,1мл бактеріальної зависі у концентрації 5×10910×109мкл/мл (за оптичним стандартом мутності) вносили у пеніцилінові флакони з 0,2% FT-агарy. Флакони зберігали у холодильнику при 4°С. 5. Проведення контрольних перевірок культури. З інтервалами 6-10-12-14 місяців культура, що зберігалася, висівалася на чашки Петрі з твердим FT-агаром для визначення кількості живих та імуногенних SR форм (табл.1). Приклад 2. Готували поживні середовища (Мак-Коя та напіврідкий FT-агар) аналогічно до прикладу 1, але концентрація FT-агарy для приготування напіврідкого середовища становила 0,4%. Подальші етапи технології - аналогічно прикладу 1 (табл.1). Приклад 3. Готували поживні середовища (Мак-Коя та напіврідкий FT-агар) аналогічно до прикладу 1, але концентрація FT-агарy для приготування напіврідкого середовища становила 0,6%. Подальші етапи технології - аналогічно прикладу 1 (табл.1). 5 37712 6 Таблиця 1 Основні показники якості культури туляремійного мікроба при зберіганні у напіврідкому середовищі з різною концентрацією FT-aгapy при 4°С Термін зберігання 6міс. 10міс. 12міс. 14міс. Ср. 10,5 0,2% % живих мікробів 87 80 78 72 79,25 % SR (імуноген.) колоній 83 75 67 60 71,25 Концентрація FT-aгapу 0,4% показники % живих мік- % SR (імуноробів ген.) колоній 83 80 80 73 78 70 75 63 79 71,5 Висновок. За результатами перевірок встановлено, що зберігання культури туляремійного мікробу на напіврідкому середовищі FT-агарy доцільно при концентраціях 0,2-0,4% протягом 12-14 місяців. Таким чином, запропонована сукупність ознак способу забезпечує використання заявленого високоефективного поживного середовища для зберігання музейних та промислових штамів туляремійного мікробу, подовження терміну зберігання культур на цьому середовищі без додаткових пасажів на нове поживне середовище, скорочення матеріальних, енергетичних та тр удови х затрат. Джерела інформації: 1. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. -М., Медицина, 1975. 2. Методы сбережения коллекционных культур микроорганизмов - под ред. Н.А. Красильникова М., Наука, 1967. Комп’ютерна в ерстка С.Литв иненко 0,6% % живих мікробів 52 50 43 40 53,75 % SR (імуноген.) колоній 70 63 50 47 57,5 3. Авторское свидетельство СССР №1730143 от 27.06.1990. Питательная среда для культивирования туляремийного микроба. - Т.П. Морозова, Л.В. Логачева и др. 4. Патент РФ №2092186. Средство для использования в комплексном лечении больных раком тела матки и раком легкого. - Адамян Р.Т.(АМ). Дата подачи 1992.12.07. Дата регистр. 1997.10.10. 5. Патент України №24567. Спосіб одержання діагностикуму для виявлення туляремійних антитіл. УкрНДПЧІ ім. І.І. Мечникова. Дата подачі 09.01.2007. Дата реєстр. 10.07.2007. 6. Патент РФ №2286576. Способ выявления перекрестнореагирующих антигенов возбудителей мелиоидоза, сапа, чумы, туляремии и туберкулеза. Волгоградский НИПЧИ. Дата подачи 2004.12.21. Дата регистр. 2006.10.27. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601