Захисне середовище для довготермінового зберігання штамів дерматофітів

Корисна модель, що передбачається, відноситься до ветеринарної біотехнології, а саме до ветеринарної мікробіології і біотехнології, зокрема до способів збереження мікроорганізмів і може бути використаний в мікробіології і біотехнології для збереження штамів дерматофітів. Мета корисної моделі забезпечити довготермінове зберігання виробничих штамів дерматофітів, які використовуються при виготовленні імунобіологічних препаратів проти дерматомікозів тварин та зберігаються в колекціях мікроорганізмів, у високоактивному стані, шля хом збереження максимальної кількості мікроспор (алейрій) дерматофітів. На сьогодні рекомендується зберігати штами дерматофітів шляхом їх пересіву на твердих агарових середовищах. Залежно від біологічних особливостей штаму, його життєздатності і стійкості до плеоморфної і фавіформної дегенерації пересіви виконують один раз на 2-4 місяці [Кашкін П.Н. і співавт.,1979, Петрович С.В.,1989]. Такий спосіб є досить трудомістким. Крім того, після 4-5 пасажів штами знижують свою біологічну активність [Жигалова Е.Е.,1951, Лемещенко Г.П. і співав., 1996]. Її відновлення потребує пасажування через організм сприйнятливих тварин і додаткової селекційної роботи. В спеціальній літературі [Курасова В.В., Костин В.В., Малиновская Л.С. Методы исследования в ветеринарной микологии. - М.: Колос, 1971.- 312 с.] маються повідомлення про те, що можливо проводити зберігання колекційних культур грибів під мінеральним маслом, в ґрунті, піску, дерев'яній стружці, торфі, при заморожуванні та у ліо фільному вигляді, причому рекомендується для зберігання готувати концентровану суспензію спор грибів, що суттєво утр уднює роботу персоналу, підвищує собівартість робіт, проте ефективність даних способів зберігання не висока (кількість життєздатних спор до кінця першого року зберігання зменшується на 60-70%). Однак найкращим способом зберігання патогенних грибів є ліофілізація [Raper К.В., Fennell D.J., Austwick P.K. The genus Aspergillus. Baltimore, 1965; Fennel D.J. Conservation of fundous cultures. Bot.Rev., 1960,26,79]. Для процесу ліофілізації велике значення має склад середовища в якому проводиться ліофілізація. В більшості випадків з цією метою використовують сироватку крові, знежирене молоко, альбумін, желатину, пептон, розчини цукрів та різні комбінації цих речовин. Прототипом об'єкту, що заявляється, може бути середовище для зберігання мікроконідій, який включає в себе зберігання суспензії мікроконідій у желатиновому середовищі, що містить желатину (4%) і сахарозу (20%). Це середовище при змішуванні його в рівних пропорціях із суспензією культури дерматофіт давало змогу підтримувати високий відсоток живих мікроконідій в процесі ліофілізації [Никифоров Л.И. Трихофития пушных зверей. Автореф. докт. дисс.,1984]. Проте за допомогою даного середовища можливо зберегти життєздатність мікроконідій у 60-70% після ліофілізації. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити оптимальне захисне середовище для зберігання мікроконідій дерматофітів після ліофілізації для довготермінового їх зберігання, шляхом введення в захисне середовище желатини, сахарози та пептону з добавками солей макро- і мікроелементів. Спосіб виконують таким чином. Культуру дерматофітів вирощують на сусло-агаровому середовищі в матрацах або чашках Петрі, протягом 15-18 діб. Потім її змивають стерильним фізіологічним розчином хлористого натру і проводять підрахунок мікроконідій у камері Горєва. Доводять концентрацію мікроконідій до 300-600 млн в 1 см 3 і змішують у співвідношенні 1:1 із захисним середовищем та ліофільне висушують. Після ліофілізації проводять підрахунок живих мікроконідій шляхом висіву на сусло-агарове середовище попередньо розведеної фізіологічним розчином сухої маси. Порівняльний аналіз з відомими технічними рішеннями в галузі ветеринарної мікробіології та біотехнології дозволяє зробити висновок, що запропоноване захисне середовище дозволяє зберегти мікроконідії дерматофітів на 10-15% краще, що відповідає критеріям "новизна" та "суттєві ознаки". Приклад 1. Сахарозо-желатинове середовище (г). Сахароза 10,0-20,0 Желатина 2,0 - 4,0 Вода дистильована до 100,0 Середовище готують і стерилізують за загальноприйнятою методикою. Суспензію мікроконідій готують як вказано вище. Для досліду брали суспензію в концентрації 300 млн мікроконідій в 1 см 3. Після ліофілізації живих мікроконідій було 221млн в 1см 3. Приклад 2. Сахарозо-желатинове середовище з пептоном (г). Сахароза 10-20,0 Желатина 2,0-6,0 Пептон 0,5-2,0 Вода дистильована до 100,0 Середовище готують і стерилізують за загальноприйнятою методикою. Суспензію мікроконідій готують як вказано вище. Для досліду брали суспензію в концентрації 300 млн мікроконідій в 1 см 3. Після ліофілізації живих мікроконідій було 216 млн в 1см 3. Приклад 3. Знежирене молоко(г). Середовище готують і стерилізують за загальноприйнятою методикою. Суспензію мікроконідій готують як вказано вище. Для досліду брали суспензію в концентрації 300 млн мікроконідій в 1 см 3. Після ліофілізації живих мікроконідій було 136 млн в 1см 3. Приклад 4. Сироватка крові коня (г). Суспензію мікроконідій готують як вказано вище. Для досліду брали суспензію в концентрації 300 млн мікроконідій в 1 см 3. Сироватку змішували з суспензією мікроконідій у співвідношенні 1:1. Після ліофілізації живих мікроконідій було 182 млн в 1см 3.. Приклад 5. Захисне середовище з желатиною, сахарозою та пептоном з добавками солей макро- і мікроелементів(г). Сахароза 10,0-20,0% Желатина 2,0-6,0 % Пептон 0,7-1,0% КН2РO4 0,3-0,7 КСl 0,3-0,6 MgSO4 0,06-1,0 FeSO4 0,06-1,0 CuSO4 0,005-0,01 ZnSO4 0,003-0,007 Агар-агар 2,5 - 5,0 Вода дистильована до 250,0 Середовище готують і стерилізують за загальноприйнятою методикою. Суспензію мікроконідій готують як вказано вище. Для досліду брали суспензію в концентрації 300 млн мікроконідій в 1см 3. Після ліофілізації живих мікроконідій було 258 млн в 1см 3. Порівняльна оцінка захисту мікроконідій в процесі ліофілізації показана в таблиці 1. Таблиця 1 Порівняльна оцінка захисту мікроконідій в різних захисних середовища х в процесі ліофілізації №з/п 1 2 3 4 5 Кількість мікроконідій Кількість мікроконідій до % живих до ліофілізації ліофілізації (млн./см 3) мікроконідій (млн./см 3) Сахарозо-желатинове середовище 300 221 73,6 Сахарозо-желатинове середовище 300 216 72 з пептоном Знежирене молоко 300 136 45,3 Сироватка крові коня 300 182 60,6 Сахарозо-желатинове середовище 300 258 86 з пептоном та з добавками солей макро- і мікроелементів Назва захисного середовища