Живильне середовище для виділення збудника туберкульозу та спосіб виділення збудника туберкульозу

1. Живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке відрізняється тим, що воно додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом C2 2 (19) 1 3 патологічного матеріалу досягається можливість скоротити тривалість інкубування матеріалу до 24 годин, не допускати ріст супутньої мікрофлори та значно прискорити видачу аналізу (у 30-90 разів) при бактеріологічній діагностиці туберкульозу. Завданням заявленого винаходу є також створення живильного середовища для виділення збудника туберкульозу, в якому за рахунок нового складу компонентів, їх кількісного співвідношення досягається можливість скоротити тривалість інкубування матеріалу до 24 годин, а час діагностики туберкульозу бактеріологічним способом зменшити у 30-90 раз. Поставлене завдання вирішується тим, що запропонований спосіб виділення збудника туберкульозу, що включає приготування живильного середовища, підготовку патологічного матеріалу, висів патологічного матеріалу на живильне середовище з наступним термостатуванням, у якому згідно з винаходом, підготовку патологічного матеріалу здійснюють шляхом обробки антисептиком та електромагнітними опроміненням протягом 30-60 хвилин з подальшим інкубуванням 24 годин при температурі 36±1°С з метою знищення спорових форм мікроорганізмів в посівній суспензії, яку вносять на живильне середовище. В переважному варіанті масове співвідношення антисептика та патологічного матеріалу складає 1:1. Поставлене завдання вирішує лея, також тим, що запропоновано живильне середовище для виділення збудника туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке, згідно з винаходом додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом - Nestogen при такому співвідношенні, мас. %: агар-агар 1-2, сухий ферментативний пептон 8-12, Nestogen 1-3, вода решта. Сукупність усіх ознак заявлених винаходів, які об'єднані єдиним творчим задумом, дозволяє одержати технічний результат, а саме скоротити тривалість інкубування матеріалу до 24 годин, підвищити чутливість методу, скоротити бактеріологічні дослідження у 30-90 разів. За рахунок нових ознак у способі виділення збудника туберкульозу: попередньої обробки патологічного матеріалу антисептиком та електромагнітним опроміненням, нового складу живильного середовища для виділення збудника туберкульозу створюється синергетичний ефект, який обумовлює скорочення тривалості інкубування матеріалу з одночасним підвищенням чутливості методу, і як результат - значне скорочення тривалості та обсягу бактеріологічних досліджень у 30-90 разів. Введення до складу середовища Nestogen активізує ріст мікобактерій збагачує його лінолевою кислотою та залізом, яких недостатньо в ферментативному пептоні у кількості заліза 0,06-0,18мг, лінолевої кислоти - 0,04-0,1мг на 100мл готового живильного середовища. Живильне середовище призначене для ефективного культивування мікробактерій туберкульозу, їх прискореного виявлення в 82163 4 інфікованому матеріалі (кров, мокротиння, сеча та інші). Ефективність запропонованого живильного середовища полягає у його специфічності, прискореному росту збудників туберкульозу в первинних посівах матеріалу. Одночасно з цим збільшується вихід - "урожайність" мікробактерій туберкульозу на живильному середовищі, що забезпечує більш високу точність діагностики туберкульозу. В результаті досліджень встановлено, що на середовищі, що використане як прототип, ріст мікробактерій з'явився через 20-60діб всіх культур, які були узяті в дослід. На запропонованому середовищі через 24 години після термостатування відмічався ріст усіх культур. Через 72 години спостерігався газонний ріст колоній мікобактерій. Якісний та кількісний вміст усіх компонентів в заявлених складах, сукупність операцій способу та його режими в заявлених межах є необхідними, оптимальними для проявлення їх позитивних властивостей та досягнення технічного результату. Запропоновані вирішення дозволяють при високому рівні чутливості скоротити бактеріологічні дослідження у 30-90 разів. Спосіб виділення збудника туберкульозу на живильному середовищі відповідно до заявленого вирішення здійснюють у наступній послідовності. Для виділення збудника туберкульозу готують живильне середовище, здійснюють підготовку патологічного матеріалу для його подальшого висіву на живильне середовище, при цьому посівний матеріал обробляють за загальновідомою методикою і, крім того, його обробляють запропонованим антисептиком з подальшим електромагнітним опроміненням і посівом на живильне середовище. За контрольне беруть живильне середовище за прототипом Контролем служили тесткультури мікроорганізмів: Mycobacterium tuberculosis H37 RV - збудник туберкульозу людей, Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobacterium bobis - збудник туберкульозу великої рогатої худоби. В якості супутньої мікрофлори використовували тест-культури Е. соlі (К 12), В. subtilis, S. epidermitidis (1225). Підготовлений контрольний посівний матеріал перед висівом обробляють антисептиком та електромагнітним опроміненням протягом 30-60 хв. з послідуючим інкубуванням при температурі 36±1*С. протягом 22-24 годин і висівали на поживне середовище. Потім патологічний матеріал (посівний матеріал - мокротиння, кров, спинномозкова рідина, частини тканин та інше), так само як і тесткультури мікроорганізмів, перед висівом обробляють антисептиком та електромагнітним опроміненням. До підготовленого згідно із загальноприйнятим методом патологічного 5 матеріалу додають антисептик у масовому співвідношенні 1:1,з подальшою обробкою електромагнітним опроміненням, з потужностю 8 герц, 50 Вт. протягом 30-60 хвилин, після чого термостатують протягом 24-48 годин при температурі 36±1°С і висівають отриману посівну суспензію в чашки Петрі на живильне середовище у дозі 1 мл. Засіяні чашки Петрі не перевертають і розташовують в термостаті кришками догори, термостатують при температурі 36±1°С протягом 1-5 діб. Поява росту колоній на 1-5 добу вказує на позитивний результат, а відсутність росту мікобактерій після 5 діб вважається негативним результатом, що підтверджує відсутність захворювання. Відсутність росту тест-культури Е. соlі, В. subtilis, S. epidermitidis на середовищі протягом 10 діб вказує на бактерицидну дію антисептика і при цьому допускається хороший ріст збудника туберкульозу. Практичне здійснення заявлених вирішень ілюструється наступними прикладами. Приклад 1 Досліди проводили при мінімальних концентраціях всіх компонентів живильного середовища, мас. %: агар-агар 1,0; сухий ферментативний пептон 8,0; Nestogen 1,0; вода решта. Живильне середовище готували розмішуючи компоненти (які попередньо були перемелені в лабораторному млину протягом 10-55 хвилин) в 100 мл очищеної води і кип'ятили 3-5 хвилин до повного розплавлення агару, фільтрували через ватно-марлевий фільтр, розливали у відповідний посуд, стерилізували при температурі 120±1°С протягом 15 хвилин в автоклаві і після охолодження при кімнатній температурі до 4050°С живильне середовище розливали в асептичних умовах в стерильні чашки Петрі по 20 мл. Через 7-10 хвилин, як правило, проходить застигання середовища, на яке проводять посів. Готове живильне середовище має білувате забарвлення з рН 7,2±0,2. Підготовлений антисептик також автоклавували при температурі 120±1°С протягом 15 хвилин в автоклаві. Підготовленим стерильним антисептиком обробляли тесткультури мікроорганізмів та патологічний матеріал у співвідношенні 1:1 з подальшою обробкою електромагнітним опроміненням, з потужністю 8 герц, 50 Вт. протягом 30 хвилин ,після чого термостатували 24 години при температурі 36°С і висівали отриману посівну суспензію в чашки Петрі на живильне середовище у дозі 1 мл. Засіяні чашки не перевертали і ставили в термостат при температурі 36±1°С протягом 5 діб. Облік результатів проводили після 24 годин інкубування в термостаті, а в подальшому щоденно до закінчення строку. В результаті проведених досліджень встановлено, що ріст колоній через 24 години спостерігався на чашках з тесткультурами Mycobacterium tuberculosis Нз7 RV - збуднику туберкульозу людей та Mycobacterium bobis збуднику туберкульозу великої рогатої худоби і 82163 6 дослідженим патологічним матеріалом. Слід визначити, що на третю добу з'явився на вищезазначених чашках газонний ріст, характерний для збудника туберкульозу. На чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався також через 24 години пригнічений ріст колоній, після 72 годин спостерігався газонний ріст. Тоді як на чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався газонний ріст колоній як через 24 години, так й після 5 діб. Результати досліджень із патологічним матеріалом були аналогічними обраним тесткультурам збудника туберкульозу, що підтверджує якість обраних компонентів. Результати досліджень росту тест-культури Е. соlі, В. subtilis, S. epidermitidis на середовищі були відсутні протягом 10 діб, що вказує на бактерицидну дію антисептика і при цьому допускається хороший ріст збудника туберкульозу на запропонованому середовищі. Приклад 2 Методика досліджень проводилась по схемі, як в прикладі 1, але кількість компонентів була середньою в межах зазначених інтервалів. Так для живильного середовища ця кількість складала, мас. %: мас. %: агар-агар 1,5; сухий ферментативний пептон 10,0; Nestogen 2,0; вода решта. Антисептик був обраний із середньою концентрацією компонентів: глюгіцир 20,0; фенол 0,4; Вода до 1000,0 Дія електромагнітного опромінення була протягом 40 хв. при 8 герц і 50 Вт. Результати досліджень в порівнянні з прикладом 1 суттєвої різниці не мали. Приклад 3 Методика досліджень проводилась по схемі, як в прикладі 1, але кількість компонентів в живильному середовищі та антисептика була максимальною в межах зазначених інтервалів. Так для живильного середовища ця кількість складала, мас. %: агар-агар 2,0; сухий ферментативний пептон 12,0; Nestogen 3,0; вода решта. Антисептик також був обраний із максимальною концентрацією компонентів: глюгіцир 30,0; фенол 0,5; водадо1000,0. Дія електромагнітного опромінення була протягом 60 хв. при 8 герц і 50 Вт. В результаті досліджень встановлено, що ріст колоній через 24 години був більш інтенсивний, ніж у прикладі 1 на чашках із тест-культурами Mycobacterium tuberculosis Н37 RV - збуднику туберкульозу людей та Mycobacterium bobis збуднику туберкульозу великої рогатої худоби і дослідженим патологічним матеріалом. Газонний ріст з'явився на другу добу на чашках Петрі, де висівали Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався ріст колоній через 24 години - більш інтенсивний, ніж у прикладі 1. На чашках Петрі, де висівали Mycobacterium 7 tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів, спостерігався газонний ріст колоній як через 24 години, так й після 5 діб; також як і у прикладі 1 дослідами із патологічним матеріалом підтверджена якість обраних ком-опонентів (відсутність росту супутньої мікрофлори та хороший ріст на запропонованому середовищі збудника туберкульозу). Запропоноване поживне середовище просте за способом його приготування, зручне при зберігання і транспортуванні. Всі компоненти заявлених складових продаються в Україні, що є досить зручним для виробничих, науководослідних лабораторій ветеринарного та медичного профілю. Джерела інформації: 1. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. - 3-е изд., переработанное и дополненное. М., Медицина, 1982, с. 79-80 (прототип для способу виділення збудника туберкульозу, живильного середовища). 2. Патент України № 18613 від 27.07.93, м. кл. С120 1/02, публ. 25.12.97, бюл. № 6. 82163 8