Спосіб кількісного визначення катехоламінів в еритроцитах у риб

Спосіб кількісного визначення катехоламінів в еритроцитах у риб, що включає цитохімічний аналіз свіжих, тонких мазків крові риб, при якому катехоламіни еритроцитів окислюють 2% водяним розчином біхромату калію, потім мазки промивають у декількох порціях дистильованої води й офарблюють 5% водяним розчином азотнокислого сріб 3 38463 мазки крові фіксують в 2% водяному розчині біхромату калію при температурі 37°С у плині 2ч і більше. Потім мазки промивають у декількох порціях дистильованої води й офарблюють 5% водяним розчином азотнокислого срібла протягом 5хв. Надлишок барвника змивають водою й офарблюють цитоплазму еритроцитів 1% водяним розчином еозину. Мазки промивають водою, збезводнюють спиртами зростаючої концентрації, після чого, мікроскопируючи під імерсією, підраховують включення катехоламінів в еритроцитах. Відомий спосіб володіє рядом недоліків: - температурні й тимчасові режими не підходять для мазків крові холоднокровних тварин; - реактиви, приготовлені за зазначеним способом, не дозволяють чітко спостерігати пофарбовані катехоламінові включення в еритроцитах; Ціль дійсної роботи - застосувати цей експресметод цитохімічного виявлення КА в еритроцитах у риб для оцінки морфофункціональної активності САС, що відбиває адаптаційний потенціал гідробіонтів і їхню пристосованість до умов середовища. Попередні результати свідчать про перспективність застосування цього методу для гідробіологічних досліджень. В основу корисної моделі поставлене завдання розробки способу кількісного визначення катехоламінів в еритроцитах риб шляхом зміни технологічних режимів, щоб забезпечити дослідників простим і надійним способом виявлення КА в еритроцитах риб для оцінки морфофункціональної активності симпатоадреналової системи риб. Поставлене завдання досягається наступним шляхом. У способі кількісного визначення катехоламінів в еритроцитах риб, що включає цитохімічний аналіз свіжих, тонких мазків крові риб, при якому катехоламіни еритроцитів окислюють 2% водяним розчином біхромату калію, потім мазки промивають у декількох порціях дистильованої води й офарблюють 5% водяним розчином азотнокислого срібла протягом 5хв, надлишок розчину азотнокислого срібла змивають водою й офарблюють цитоплазму еритроцитів розчином еозину. Мазки промивають водою, і під мікроскопом підраховують включення катехоламінів у еритроцитів. Спосіб, що заявляється, відрізняється тим, що перед окислюванням біхроматом калію мазки крові ретельно просушують перед вентилятором при кімнатній температурі протягом 1 години, фіксують у водяному розчині біхромату калію при температурі 37-42°С у плині 1 години 40 хвилин, а цитоплазму еритроцитів офарблюють 1% спиртовим розчином еозину протягом 20-30 хвилин, водні розчини 2% біхромату калію й 5% азотнокислого срібла готували на деіонизованій воді. Пропонований спосіб реалізується таким чином. Свіжі, тонкі мазки крові риб ретельно просушують на повітрі під вентилятором приблизно 1 4 годину. Добре висушені мазки фіксують в 2% водяному розчині біхромату калію при температурі 37-40°С 1 годину 40хв у термостаті. Потім мазки промивають більшою кількістю дистильованої води й поміщають на 5 хвилин в 5% водяний розчин азотнокислого срібла. Надлишок розчину азотнокислого срібла змивають більшою кількістю дистильованої води й офарблюють цитоплазму еритроцитів 1% спиртовим розчином еозину. Мазки промивають дистильованою водою й висушують на повітрі. Розчини 2% біхромату калію й 5% азотнокислого срібла готували на деіонизованій воді. Підраховували пофарбовані гранули катехоламінів під мікроскопом. Приклад Свіжі, тонкі мазки крові риб (йоржа, налима, барабулі, горбиля, бичків і т.д.) ретельно просушували на повітрі під вентилятором приблизно 1 годину. Добре висушені мазки фіксували в 2% водяному розчині біхромату калію при температурі 3740°С 1 годину 40хв у термостаті. Потім мазки промивали більшою кількістю дистильованої води й поміщали на 5 хвилин в 5% водяний розчин азотнокислого срібла. Надлишок барвника змивають більшою кількістю дистильованої води. Дофарбовували цитоплазму еритроцитів 1% спиртовим розчином еозину не менш 20 хвилин. Мазки промивали дистильованою водою й висушували на повітрі. Розчини 2% біхромату калію й 5% азотнокислого срібла готовили на деіонизованій воді. Підраховували пофарбовані гранули катехоламінів під мікроскопом. Кількісну оцінку змісту катехоламінів проводили за методикою хрестів. Показано, що концентрація еритроцитів, що вміщують катехоламіни, у крові йоржів із забруднених бухт становить 36,42%, у той час як цей же показник у йоржів з умовно чистого району - 28,19%. У зв'язку з тим, що при мікроскопированні цитохімічних препаратів дуже важлива чіткість бачення пофарбованих аналізованих структур, запропонований спосіб володіє рядом переваг: - запропонований новий ефективний спосіб цитохімічного визначення катехоламінів у ядерних еритроцитах риб і інших холоднокровних; - готування розчинів 2% біхромату калію й 5% азотнокислого срібла на деіонизованій воді замість дистильованої забезпечує чітке бачення пофарбованих гранул катехоламінів під мікроскопом; - дофарбування цитоплазми еритроцитів 1% спиртовим розчином еозину замість 1% водяного розчину еозину не менш 20 хвилин забезпечує чітке розрізнення пофарбованих гранул катехоламінів під мікроскопом; - розроблені температурні й тимчасові режими обробки мазків забезпечують чітке бачення пофарбованих гранул катехоламінів під мікроскопом. Заявлений спосіб може бути використаний як експрес-метод для оцінки якості води. 5 Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 38463 6 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601