Спосіб культивування калусної тканини гінкго дволопатевого (ginkgo biloba l.)

Спосіб культивування калусної тканини гінкго дволопатевого (Ginkgo biloba L.), що включає виділення експланту, стерилізацію і культивування 3 38462 0,5мг/л, індоліл-3-оцтової кислоти (ИУК) - 1,01,5мг/л, цикл вирощування складає близько 70-90 діб, що забезпечує отримання калусних культур, здібних до проліферації. Гінкго є однією з широко використовуваних в медицині лікарських рослин. У деяких країнах дана рослина є традиційним джерелом лікарських препаратів, і широко використовується в офіційній і народній медицині. У основі високої біологічної активності гінкго лежить наявність в біомасі біологічно активних речовин терпенової і фенольної природи (ліналоола і його ефірів, цимолу і тимолу, білобаїдів і білобанонів, гінгколидів А, В, З, Μ і J), речовин флавонолової природи (похідних кемпферола, кверцетину, мирицетина), біфлавоноїдів і їх похідних (сиядопитизина, білобетин, гінкгетин, ізогінкгетина, аментофлавон, антоціанідин), поліпренолів, стиролів, органічних кислот (масляної, шикимової, валеріанової, гінкголової, хінної і лінолевої), катехинів, танидів, ефірних масел, фенолів і їх похідних (анакардатової кислоти, саліцилової кислоти), смол, фітостеролів, природних полісахарів і вітамінів (каротин, полісахара GF1, GF2, GF3, манан, пентозан, крохмаль). Екстракти гінкго, що містять суму або окремі фракції перерахованих з'єднань, використовуються у фармакології і сучасній медицині, зокрема, при наступних патологічних станах і захворюваннях: депресії, при зміцненні нервової системи, при розладах уваги і гіперактивності, мігрені, хворобі Альцгеймера, розсіяному склерозі, зміцненні серцево-судинної системи, лікуванні атеросклерозу, алергії, астми, цукровому діабеті, для поліпшення функції зору, при катаракті, глаукомі і дегенерації жовтої плями сітківки. Використання замість інтактних рослин їх клітинних культур, одержаних біотехнологічними методами, має ряд переваг: зменшення антропогенного впливу на дику природу, можливість отримання фітомаси, що не містить полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів і ін.), можливість управління процесом біосинтезу цільових продуктів і т.д. Спосіб реалізується таким чином: Приклад 1. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу по пропису Мурасіге і Скуга (Murashige Т., Skoog F., //Phisiol.Plant. -1962. - Bd.15. -№13 P.473-497ї, агар - 8000, тіамін - 1,0, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота 5,0мг/л. Фітогормони: індоліл-3-оцтова кислота 1,5мг/л; 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 1,5мг/л, 6-бензиламінопурін - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2´20см), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 40 хвилин, pH середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти стебла Ginkgo biloba L, що не одеревіло), заздалегідь простерилізовані 50% розчином препарату брадофен (3 хвилини), 70% етанолом (3 хвилини) і 15% перекисом водню (5 хвилин), а потім витримані в заздалегідь 4 проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти в темряві при 25°С в протягом 80 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланта, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Дані по частоті калусоутворення приведені в таблиці. Приклад 2. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга [Murashige Т., Skoog F., //Phisiol.Plant. -1962. - Bd.15. -№13 P.473-497], агар - 8000, тіамін - 1,0, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота 5,0мг/л. Фітогормони: індоліл-3-оцтової кислоти 1,0мг/л; 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 1,5мг/л, 6-бензиламінопурин - 0,4мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2´20см), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С в плині 40 хвилин, pH середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти зрілої листової пластинки Ginkgo biloba L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином препарату брадофен (3 хвилини), 70% етанолом (3 хвилини) і 15% перекисом водню (5 хвилин), а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді на протязі 5 хвилин. Культивують експланти в темряві при 25°С протягом 70 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланта, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Дані по частоті калусоутворення приведені в таблиці. Приклад 3. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга [Murashige Т., Skoog F., //Phisiol.Plant. - 1962. - Bd.15. -№13 P.473-497], агар - 8000, тіамін - 1,0, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота 5,0мг/л. Фітогормони: індоліл-3-оцтова кислота 1,0мг/л; 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 2,0мг/л, 6-бензиламінопурин - 0,5мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2´20см), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С в протягом 40 хвилин, pH середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти зрілих листових пластинок Ginkgo biloba L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином препарату брадофен (3 хвилини), 70% етанолом (3 хвилини) і 15% перекисом водню (5 хвилин), а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С на протязі 75 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланта, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Дані по частоті калусоутворення приведені в таблиці. Приклад 4. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга [Murashige 5 38462 Т., Skoog F., //Phisiol.Plant. - 1962. - Bd. 15. -№13 P.473-497], агар - 8000, тіамін - 1,0, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота 5,0мг/л. Фітогормони: індоліл-3-оцетової кислоти 1,0мг/л; 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 2,0мг/л, 6-бензиламінопурин - 0,4мг/л, розливають в культуральні судини (пробірки 2´20см), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 40 хвилин, pH середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти молодого листя Ginkgo biloba L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином препарату брадофен (3 хвилини), 70% етанолом (3 хвилини) і 15% перекисом водню (5 хвилин), а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді протягом 5 хвилин. Культивують експланти на світлі при 25°С на протязі 80 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Дані по частоті калусоутворення приведені в таблиці. Приклад 5. Готують живильне середовище Мурасіге і Скуга, яке містить мінеральні солі, мікроелементи, і 6 сахарозу за прописом Мурасіге і Скуга [Murashige Т., Skoog F., //Phisiol.Plant. - 1962. - Bd.15. - №13 P.473-497], агар - 8000, тіамін - 1,0, піридоксин 0,5, нікотинова кислота - 1,0, аскорбінова кислота 5,0мг/л. Фітогормони: індоліл-3-оцтової кислоти 1,5мг/л; 2,4-дихлорфеноксіоцтова кислота 1,0мг/л, 6-бензиламінопурин - 0,4мг/л розливають в культуральні судини (пробірки 2´20см), по 20мл живильного середовища, закривають ватяномарлевими пробками, стерилізують в автоклаві при 121°С протягом 40 хвилин, pH середовища до автоклавування 5,5-5,8. На поверхню середовища, що остигнуло, в стерильних умовах вводять експланти (сегменти молодого листя Ginkgo biloba L.), заздалегідь простерилізовані 50% розчином препарату брадофен (3 хвилини), 70% етанолом (3 хвилини) і 15% перекисом водню (5 хвилин), а потім витримані в заздалегідь проавтоклавованій дистильованій воді в протягом 5 хвилин. Культивують експланти в темряві при 25°С протягом 90 діб, після чого калус виймають з судини, відокремлюють від експланту, і висаджують на живильне середовище такого ж складу. Дані по частоті калусоутворення приведені в таблиці. Таблиця Частота калусоутворення в культурі тканин гінкго дволопатевого, в залежності від типу експланта, складу живильного середовища і умов культивування Тип і концентрація фітогормонів в живильному № п/п середовищі, мг/л ИУК 2,4-Д 1,5 1,5 0,5 2 1,0 1,5 0,4 3 1,0 2,0 0,5 4 1,0 2,0 5 1,5 1,0 Умови культивування Частота калусоутворення % 6-БАП 1 Тип експланта Сегменти стебла, що не одеревіло Темрява, 125°C Сегменти зрілої листової пластинки Темрява, 125°C Сегменти зрілої листової пластинки Світло, 125°C 0,4 Сегменти молодого листя Світло, 125°C 50,0 0,4 Сегменти молодого листя Темнота, 125°C 45,0 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко Підписне 45,0 70,0 86,6 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601