Спосіб визначення катехоламінів в біологічних зразках

Спосіб визначення катехоламшів у біологічних зразках, який містить обробку зразків розчинами кислот з наступним центрифугуванням, екстракцію на оксиді алюмінію та хроматографічний аналіз, який відрізняється тим, що екстракцію здійснюють після попереднього активування оксиду алюмінію прожарюванням його у муфельній печі при температурі 600-700°С на протязі 3,5-4,5 годин до постійної ваги, після чого його обробляють кислим розчином (0,1 М НСІ), а хроматографію проводять з використанням монолітної силіконової колонки з бімодапьними порами та УФ-детектором Винахід відноситься до дослідження чи аналізу катехоламшів в біологічних матеріалах (тканинах мозку, крові) шляхом розподілу на компоненти, визначення їх ХІМІЧНИХ та фізичних властивостей, з застосуванням хроматографії, і може бути використаний в медицині для розробки та оцінки нових препаратів для лікування широкого кола захворювань, а також у діагностиці Катехоламіни - сполуки, які входять до составу клітин живих організмів, відносяться до біогенних амінів Містять 3,4-діпдроксифенільне (пірокатехінове) кільце та бокову групу - етіламшову або етаноламшову, пстамінову, холінову, ацетилхолінову, індольну Концентрація катехоламшів в біологічних матеріалах, наприклад в тканинах або крові, як правило, дуже низька Наприклад, вміст катехоламшів в ткані (волога маса) менше 10нмоль/г або 0,1-0,5мкг/л в сироватці крові [1] Необхідність в визначенні низьких концентрацій катехоламшів в біологічних рідинах, тканинах окремих ділянок мозку, популяціях клітин стимулює розробку ВІДПОВІДНИХ аналітичних методів, які б забезпечували чуттєве та точне вимірювання цього класу сполук Суттєвого прогресу в цьому напрямі вдалося досягти завдяки швидкому розвитку високоефективної рідинною хроматографії (ВЕРХ) без попередньої екстракції вприскували в хроматограф з двома спареними колонками Першу, колонку С1 - з катюн-обмшним носієм (Zipax SCX, 100х4мм, Du Pont, USA) - використовували для очищення зразків Другу, С2 - зворотньо-фазову (Nucleosil 100-7Сі8, 300хЗ,9мм, Macherey-Nagel, Germany) -для розподілу сполук Застосовували дві мобільні фази 0.05М розчин хлорної кислоти, 0 064М розчин лимонної кислоти до якого додавали 0.175М розчин натрію фосфорнокислого двузаміщеного (ІЧагНРОД 0,1 М розчин натрієвої солі етілендіамштетраоцтової кислоти (Na2EDTA), 0,50мМ натрієвої солі 1-октан сульфонової кислоти та ЮОмл метанолу Остаточне рН розчину- 3,2 Детектор - електрохімічний Швидкість потоку 1,0мл/хв Час утримання ДОФА - 7,4хв, 3-ОМД 14,1хв, а-метил ДОФА - 12,5хв В літературі описано спосіб виявлення катехоламшів методом ВЕРХ, а саме 3,4дипдроксифенілаланшу (L-ДОФА) та його метильованого метаболіту-3-О-метил ДОФА (3-ОМД) в супернатанті депротешізованої плазми [2] Зразки Є відомим метод вимірювання ДОФА (1), дофамшу пдрохлориду (2), епшефрину (3), норепінефрину (4), а-монофторметил ДОФА (5), адіфторметил ДОФА (6) та а-метил ДОФА (7) в тканинах мишей та щурів за допомогою зворотньофазової юн-парної хроматографії з електрохімічним детектором [3], В роботі використовували зворотньо-фазові колонки pBondapak C-is (Юмкм, 300хЗ,9мм, Waters, USA), LiChrosorb RP-18 (Юмкм, 250x4,6мм, Н Knauer, Germany) Детектування електрохімічне Мобільну фазу готували з буферу та метанолу у співвідношенні 85 15 (v/v), рН 3,25-3,35 Буфер готували з 2-х об'ємів 0.02М лимонної кислоти та 1-го об'єму 0.02М (О ю 1 ю 57456 лишається актуальним питання подальшого вдосконалення оптичних методів виявлення флуоресцентних, хемілюмінесцентних, ультрафіолетових Завданням запропонованого винаходу є розробка способу визначення катехоламшів в біологічних зразках, який, по-перше, був би більш чутливим, а, по-друге, розширив би сферу його застосування Поставлена мета досягається за рахунок того, що в способі визначення катехоламшів у біологічних зразках, який містить обробку зразків розчинами кислот з наступним центрифугуванням, екстракцію на оксиді алюмінію та хроматографічний аналіз, згідно з запропонованим винаходом, екстракцію здійснюють після попереднього активування оксиду алюмінію його прожарюванням у муфельній печі при температурі 600-700°С на протязі 3,5-4,5 годин до постійної ваги, після чого вже обробляють кислим розчином (0,1 М НСІ) , а хроматографію проводять з використанням монолітної силіконової колонки з бімодальними порами та Прототипом способу, що пропонується є виУФ-детектором значення катехоламшів, а саме 3,4дипдроксифенілаланшу (L-ДОФА), дофамшу пдЗастосування вищезгаданих ПІДХОДІВ при ПІДрохлориду, 5-8-цистешіл-ДОФА, 2-метіл-3-(3,4ГОТОВЦІ біологічних зразків дозволило підвищити діпдроксифеніл)-ОЬаланшу (а-метил ДОФА) в відсоток виходу катехоламшів, завдяки чому поплазмі крові, тканинах мозку та сечі нормальних та кращилася чутливість способу, а використання хворих на меланому людей [5] БІОЛОГІЧНІ зразки монолітної силіконової колонки з бімодальними обробляли таким чином проби крові збирали у порами та УФ-детектору, в свою чергу, покращило центрифужні пробірки, які містили N32EDTA, пласелективність розподілу та підвищило точність зму отримували центрифугуванням, сечу збирали вимірювань Відомо, використання ВЕРХ, з такою в пляшечки, які містили 50мл оцтової кислоти та 1 ж самою колонкою, разом з капілярним електрог натрію метабісульфіту, зразки тканин екстрагуфорезом для перевірки чистоти феноксиметилпевали 0,4М розчином НСІ Алюмоекстракцію катеніцилшута ампіциліну [6] холамшів проводили на оксиді алюмінію, промитоСпосіб, що пропонується як винахід, описано го розчином НСІ Катехоламши елюювали 0,4М нижче на прикладах В усіх прикладах визначення розчином хлорної кислоти, центрифугували, після катехоламшів в біологічних зразках здійснюють в чого надосадочну рідину, що містила катехоламітри етапи ни, аналізували в хроматографі та обчислювали 1) обробка біологічних зразків, відсоток їх виходу Розподіл проводили на зворот2) екстракція катехоламшів, ньо-фазовій колонці (Yanaco ODS-A, 7мкм, 3) хроматографічний аналіз 250x4,6мм, Japan) при температурі 40°С Мобільна Приклад 1 (контрольний) фаза містила 10г/л фосфорної кислоти, 7г/л мета1 Обробка біологічних зразків Для роботи винсульфонової кислоти, рН2,35 Швидкість потоку користовували білих безпородних щурів-самців 0,7мл/хв, детектор електрохімічний Час утриманвіком 4-6 МІСЯЦІВ, з масою тіла 200-250г Зразки ня для ДОФА - 10хв, дофамшу - 11 хв, 5-5крові збирали у центрифужні пробірки, які містили цистешіл-ДОФА - 15,5хв , МДОФА - 21 хв 10% розчин трихлороцтової кислоти (ТХО), у співвідношенні 1мл крові 9мл ТХО Плазму отримуваНаведений спосіб є необхідним при виявленні ли центрифугування на протязі 15 хвилин, при рівня 5-8-цистешіл - ДОФА, який вказує на ступінь 2000об/хв, центрифуга К-23 (Германія) До проверозростання меланоми, що дуже важливо для діадення аналізу всі зразки зберігали замороженими гностики цієї хвороби, також ретельно описано, як при -6°С обробляються біологічні проби до хроматографічного аналізу, однак деяка суперечливість резуль2 Екстракція катехоламшів Екстракцію катетатів та помірний відсоток виходу катехоламшів холамшів 3,4-дипдроксифенілаланшу (ДОФА), 3спонукає до нових пошуків більш точного та селекпдрокситірамш-пдрохлориду (ГТГХ), 3,4тивного методу дипдроксифеніл-2-метилаланшу (МДОФА) - на оксиді алюмінію (АЬОз) проводили за прототипом Недоліком цього способу є те, що його відпра50мг підкисленого оксиду алюмінію клали у конічну цьовано переважно для виявлення високого рівня пластикову пробірку (МІСТКІСТЮ 1,5МЛ), додавали 5-8-цистешіл-ДОФА у людей, хворих на меланому ЮОмкл 2 %-ного розчину (у відношенні маси до Крім того, він є недостатньо чутливим, рівень 5-8об'єму) метабісульфіту натрію і Юмкл розчину цистешіл-ДОФА виявляється за допомогою елект10мкг/мл МДОФА (3,4-діпдроксифеніл)аланш у рохімічного детектора Як свідчать літературні 0,1моль/л розчину соляної кислоти як внутрішній данні [1], застосування електрохімічних детекторів стандарт Також до пробірки додавали 1,0мл плав рутинному аналізі приводить до значних розбігів зми і 0,3мл 0,01 М трис-НСІ буферу, рН8,6, або границь виявлення катехоламшів Наприклад, ріЮмкл стандартного розчину, який містив по вень дофамшу може коливатися від 500, 200, 100, 1,0мкг/мл ДОФА, МДОФА та ГТГХ у 0,1 М розчині 53, 20 до 15 пг [1] 3 цієї та ряду інших причин заШвидкість потоку 1мл/хв Час утримання для компонентів, що аналізуються, ВІДПОВІДНО такий 4 4хв, 3 - бхв, 1 - 7,5хв, 5 - Юхв, 6 - 12,5хв, 2 13,5хв, 7 - 17,5хв Також описано виділення дофамшу та дофамш-споріднених тетрапдроізохінолінів за допомогою зворотньо-фазової рідинної хроматографії, зворотньо-фазової юн-парної хроматографії, та юн-обмінної хроматографії з ультрафіолетовим детектуванням (довжина хвилі 280нм) [4] Дофамін та дофамш-споріднені тетрапдроізохінолши були виділені в ПОСЛІДОВНОСТІ сальсолінол-1-карбонова кислота (1), дофамін (2), сальсолінол (3), 7метилсальсолінол-і-карбонова кислота (4) Колонки Li Chrosorb RP 18 (250x4,6, Юмкм, Bischoft GmBH), Nucleosil 10 SA (Юмкм, 250х4,6мм, Bischoft GmBH), мобільна фаза готувалася з цитратно-фосфатного буферу, рН4,5, та метанолу Швидкість потоку - 1,0мл/хв Час утримання 1 5,58хв, 2 - 6,48 хв, 3 - 9,35хв, 4 - 12,32хв НСІ Катехоламіни адсорбували на оксиді алюмінію шляхом додавання 1,5моль/л буферного розчину тріс-НСІ, який містив 2% (у відношенні маси до об'єму) Na2EDTA (рН8,6), струшували на качалці МІМ (Угорщина) 5хв, а потім центрифугували ЗО хвилин при 5000об/хв на центрифузі (ЦНЛ-2, Росія) ПІСЛЯ центрифугування оксид алюмінію ДВІЧІ промивали у 1,5мл води Потім катехоламіни елюювали 0,15мл 0,1М НСІ шляхом струшування протягом 2хв Після центрифугування на протязі 5 хвилин при 3000об/хв, Юмкл супернатанту інжектували до системи ВЕРХ З Хроматографічний аналіз Хроматографічні дослідження катехоламшів проводили на високоефективному рідинному хроматографі "LKB" (Швеція) Модель контролера -2152, UV-детектора 2151 Колонка Chromohth-RP-18, 100-4,6 (Merck, Germany) Вимірювання проводили при кімнатній температурі Мобільна фаза містила 0.02М натрійфосфатний буфер, рН2,1, та метанол у співвідношенні 90 10 (v/v) Швидкість потоку - 0,5мл/хв Довжина хвилі - 220нм Катехоламіни КІЛЬКІСНО визначали за співвідношенням висоти ПІКІВ МІЖ катехоламшами (зразками) та МДОФА (стандартом) Приклад 2 1 Обробка біологічних зразків Обробка зразків крові здійснюється так, як це описано у прикладі 1 Зразки з тканин мозку готували наступним чином Тканини гомогенізували в 0,1 М розчині НСІО4 у співвідношенні 4 1 (маса/об'єм) Гомогенат центрифугували при 6000об/хв на протязі 1,5год при +4°С Для екстракції на оксиді алюмінію брали ЮОмкл тканинного екстракту і 0,5мл 0,01 М трис-НСІ, рН8,6 2 Екстракція катехоламшів Оксид алюмінію сушили до постійної ваги у муфельній печі на протязі 3,5 годин при температурі - 600-700°С, потім обробляли 0,1 М розчином НСІ Далі, активований оксид алюмінію використовували для екстракції за процедурою, описаною в прикладі 1 3 Хроматографічний аналіз Хроматографічні дослідження проводили при тих самих умовах, що і в прикладі 1, але при рН мобільної фази 2,25 і швидкості потоку-0,7мл/хв Приклад З 1 Обробка біологічних зразків Обробка біологічних зразків здійснюється так, як це описано у прикладах 1 і 2 2 Екстракція катехоламшів Оксид алюмінію сушили до постійної ваги у муфельній печі на про 57456 тязі 4,5 годин при температурі - 600-700°С, потім обробляли 0,1М розчином НСІ Алюмоекстракцію здійснювали так, як це описано у прикладі 1 З Хроматографічний аналіз Хроматографічні дослідження проводили із застосуванням градієнтної елюції Елюенти А - 0,1% трифтороцтової кислоти, рН1,85, В - метанол Температура - кімнатна, довжина хвилі - 220нм Швидкість потоку 0,5мл/хв Профіль елюції 0-5хв, 0-5% В, 5-15хв, 510% В Збіжність результатів вимірювань перевіряли шляхом введення в хроматограф 5-6 проб з одного бюзразку Величина відносного стандартного відхилення становила менше 1,5% для ДОФА, 1,3% для ГТГХ і 1,1% для МДОФА Дві серії експериментів були проведені для виявлення відсотку виходу катехоламшів в процесі екстракції В першому випадку, розчини з відомою КІЛЬКІСТЮ катехоламшів додавали до оксиду алюмінію, обробленого, як описано в прикладах 1 і 2, потім шжектували їх в хроматограф Отриманні значення обчислювали за внутрішнім стандартом (МДОФА) Вихід виражали, як процент відношення рівня катехоламшів після алюмоекстракцм та рівня при прямому шжектуванні відомих розчинів (контроль) 3 табл 1 видно, що відсоток виходу катехоламшів за способом що пропонується, є вищим порівняно з прототипом У другому випадку, стандартні розчини додавали до плазми крові або до гомогенату тканин мозку перед алюмоекстракцією Вихід виражали по різниці між значеннями з і без додавання стандартних розчинів Дані наведено в табл 2 Кількісне значення виходу ДОФА вище, ніж у прототипу Тенденція залежності виходу катехоламшів для гомогенатів тканин є аналогічною Таким чином, описаний вище спосіб виявлення катехоламшів завдяки підвищенню чутливості дає змогу усунути труднощі, з якими стикаються під час досліджень у зв'язку з низьким рівнем катехоламшів в біологічних зразках, а також уникнути помилок через втрату зразків та неповну екстракцію До того ж цей спосіб можна використовувати для виявлення не тільки 5-8цистешіл-ДОФА (у людей, хворих на меланому), а різних катехоламшів та їхніх метаболітів при діагностуванні широкого кола захворювань, наприклад, таких, як наркоманія, алкоголізм, а також при допінг-контролі спортсменів Заявник Інститут хіми високомолекулярних сполук НАМ України 57456 Таблиця 1 Вихід катехоламінів в стандартних розчинах після алюмоекстракцм Параметри та характеристики Сполука ДОФА ГТГХ 5-3-цистешілДОФА а-МДОФА Показники параметрів та характеристик Спосіб, який пропонується ПреЭТОТИП За прикладом 1 (конЗа прикладом 2 За прикладом 3 трольний) Середи є Середи є Середи є Середи є відношення відношення відношення відношення Вихід, % Вихід, % Вихід, % Вихід, % доадоадоадоаМДОФА МДОФА МДОФА МДОФА 74,3±1,6 1,06 89,7±1,7 0,88 99,5±0,7 1,0 76,4±1,4 1,02 76,8±3,1 1,15 81,2±2,8 0,98 99,2±12, 1,0 69,6±3,7 1,08 77,8±2,8 1,01 79,5±4,1 1,00 99,7±2,3 1,0|74,9±1,5 1,00 Значення наведено для п'яти визначень, р