Спосіб визначення антиоксидантної стійкості біологічного субстрату

Спосіб визначення антиоксидантної стійкості біологічного субстрату шля хом дослідження його окислення, який відрізняється тим, що досліджують кінетичні параметри хемілюмінесценції, ініційованої гідроген пероксидом, і антиоксидантну стійкість визначають за формулою: Винахід відноситься до медицини, а саме до імунологічних методів дослідження, і може застосовува тися в лікувально-профілактичних і науководослідних закладах для визначення антиоксидантної стійкості (АОС) в клітинах, в крові, слині, сечі та інших біологічних субстрата х, а також в системах in vitro при випробуванні антиоксидантної дії різних препаратів. Визначення АОС біологічного субстрату широко використовується в біології та медицині з діагностичною та прогностичною метою. Це дослідження проводять хворим при дії активаторів вільнорадикального окислення (ксенобіотики, лікарські препарати, іонізуюча радіація та ін.), в системах in vitro та in vivo, при старінні, розвитку запалення, пухлинному рості і багатьох інших фізіологічних та патологічних процесах в організмі. Відомі способи визначення АОС базуються на непрямих вимірах показника і заключаються, головним чином, в визначенні вторинних, побічних або кінцевих продуктів окислення, тому не дозволяють контролювати загальну АОС біологічного субстрату та мають низьку точність. Це знижує інформативність отриманих даних, знижує їхню діагностичну, прогностичну цінність і обгрунтовує необхідність створення більш точного способу визначення АОС біологічного субстрату. Так, відомі непрямі способи визначення АОС стійкості біологічного субстрату шляхом дослідження вмісту в ньому кінцевих, побічних та вторинних продуктів перекисного окислення ліпідів, окислених форм ДНК (оксі-ДНК, шиффові основи, дієнові кон'югати, газоподібні продукти та ін.), з наступним порівнянням показників зі значенням норми, які одержані в групі здорових осіб [1]. Однак, ці способи напівкількісні, непрямо відображають АОС окремих класів молекул, не дозволяють прямо виміряти показник н біологічному субстраті, трудоємкі, багатоетапні, що знижує точність визначення АОС [2]. Найбільш близьким до технічного вирішення являється спосіб оцінки АОС біологічного субстрату шляхом визначення його окислення при інкубації з високоокислювальную системою жовткових ліпопротеїдів та наступною кількісною оцінкою концентрації малонового діальдегіда (МДА), який утрюється в реакції [3]. Чим менше МДА утворилось, в порівнянні з контролем, тим вище АОС біологічного субстрату. В цьому способі, на відміну від інших, використовується чутлива до антиоксидантної дії система жовточних ліпопротеїдів, а також окислювач, котрий ініціює реакцію, та біологічний субстрат, котрий її гальмує. Шляхом визначення величини зниження вмісту МДА після додавання біологічного субстрату оцінюють його АОС. Однак, таке дослідження багатоетапне, потребує використання додаткового важкостандартизуємого біологічного компонента - жовткових ліпопротеїдів, а також базується на визначенні вторинних продуктів МДА. Ці продукти відображають рівень окислення тільки ліпідних молекул, але не ферментів, білківхелаторів і ДНК [3]. Окрім того, цей спосіб не враховує дії гідрофільних антиоксидантів, тому не дозволяє виявити загальну антиоксидантну стійкість 1 × tgα UA (11) 38569 (13) A × 100 , å ХЛ де: tg кута альфа - десятинне значення тангенса кута нахилу кривої хемілюмінесценції між показниками 1-ої і 4-ї хвилинами вимірювання; SХЛ світлосума світіння проби за весь період вимірювання в імп/сек. (19) АОС = 38569 досліджуваних об'єктів, що знижує точність дослідження АОС, звужує інформативність отриманих даних і їхнє використання з діагностичними та прогностичними цілями. В основі нашого винаходу поставлена задача створити спосіб, який дозволяє підвищити точність визначення АОС клітин і тканин організму шляхом прямого кількісного автоматизованого вимірювання інтегрального показника АОС, котрий відображає стан як гідрофільних так і гідрофобних антиоксидантів в досліджуваному субстраті. Це можливо при оцінці кінетики хемілюмінесценції біологічного субстрату - принципово іншого біологічного параметра, ніж продукти окислювальної реакції, які визначалися в відомих раніше способах. Ме тод хемілюмінесценції відрізняється високою чутливістю, в порівнянні з біохімічними методами, які використані в прототипі, та дозволяє виявляти продукти реакції в концентрації 10-8М/мл, на декілька порядків вище, ніж в відомих способах. Кінетика хемілюмінесценції біологічного субстрату прямо відображає інтегральний внесок різних антиоксидантів в розвиток реакції на ранніх і пізніх етапах, дозволяє виявляти варіанти поетапних змін АОС та стандартизувати їх, розробити на основі цих параметрів уніфіковану формулу для визначення АОС. Технічним результатом такого вирішення є підвищення точності, автоматизація і скорочення етапів визначення АОС біологічного субстрату, що значно підвищує е фективність діагностики та прогнозування багатьох патологічних процесів в організмі, об'єктивізує розробку показників до використання антиоксидантів і оцінку ефективності їхньої дії. Завдання досягається тим, що в відомому способі визначення антиоксидантної стійкості біологічного субстрату досліджують його окислення, а згідно винаходу, в способі досліджують кінетичні параметри хемілюмінесценції, ініційованої гідроген пероксидом, і антиоксидантну стійкість визначають за формулою: АОС = сценції - кута нахилу кривої світіння між першим і другим спалахами, а також показника загальної світлосуми світіння, що дозволяє врахувати участь різних антиоксидантних компонентів, які гальмують утворення активних кисневих метаболітів на всіх етапах ланцюга вільнорадикальних реакцій в досліджуваному біологічному субстраті. Стосовно дотримання критерію «суттєві відмінності» можна сказати, що спосіб суттєво підвищує точність та інформативність оцінки АОС біологічного об'єкту: передбачає можливість визначення її в динаміці, а також грунтується на використанні найбільш адекватних задачі, прямих, автоматизованих високочутливих методів вимірювання. За даними літератури такі способи визначення АОС невідомі. Спосіб здійснюється наступним чином. Досліджувальний біологічний субстрат - зразок сироватки крові, слини, клітин в кількості 0,2 мл (або 2 млн. клітин в 0,2 мл фізіологічного розчину) вносять в кювету хемілюмінометра з 1,8 мл розчину Хенкса без індикатора, рН 7,2, інкубують в темряві 5 хвилин при 37°С, визначають фон спонтанного світіння, потім додають до проби 0,3 мл 1,5% розчину гідроген пероксиду і вимірюють кінетику хемілюмінесценції за 60 циклів при нижньому рівні 1 mV. Показник антиоксидантної стійкості (АОС) розраховують за формулою: АОС = 1 × tgα × 100 , å ХЛ де: tg кута альфа - десятинне значення тангенса кута нахилу кривої хемілюмінесценції між показниками 1-ої і 4-ї хвилинами вимірювання; SХЛ світлосума світіння проби за весь період вимірювання в імп/сек. Конкретний приклад: Визначали АОС сироватки крові хворої М.Г.Кко з діагнозом: ішемічна хвороба серця. Стабільна стенокардія ІІ-ІІІ-го функціонального класу. ХНК-І. Коронарний кардіосклероз. Кров забирали у пацієнтки в кількості 1 мл з кубітальної вени натщесерце, сироватку відділяли шляхом центрифугування і вносили в кювети хемілюмінометра (ХЛМ1Ц-01 вир-ва з-ду ім. Корольова) в кількості 0,2 мл з 1,8 мл розчину Хенкса без індикатора. Після 5 хвилин інкубації в біостаті хемілюмінометра при 37°С встановлювали нижній рівень вимірів 1 мВ і вимірювали спонтанне світіння проби за 10 секунд в режимі віднімання фона установки. Підраховували середнє значення показника, котре було 14 імп/сек. Потім в пробу вносили 0,3 мл 1,5% розчину гідроген пероксиду та виміряли кінетичні параметри хемілюмінесценції за 60 циклів. Підраховували інтегральний показник світлосуми світіння проби - SХЛ (56,4 імп/сек) і показники хемілюмінесценції за 1-у і 4-у хвилини вимірів в імп/сек. Визначали транспортиром кут нахилу кривої, яка з’єднує середні значення показників світіння проби на 1-ій (30,7 імп/сек) і 4-ій хвилинах (3,5 імп/сек) вимірювання та за таблицею логарифмів підраховували десятинне значення тангенса кута (53°), яке було 1,327. Отримані значення підставляли в формулу: 1х1,327х100/56,4=2,4. Підраховували показник АОС, котрий був 2,4 при значеннях контролю 6 від. од., що свідчить про зниження АОС в 2,5 рази, в зрівнянні з нормою. 1 × tgα × 100 , å ХЛ де: tg кута альфа - десятинне значення тангенса кута нахилу кривої хемілюмінесценції між показниками 1-ої і 4-ї хвилинами вимірювання; SХЛ світлосума світіння проби за весь період вимірювання в імп/сек. Відмінними особливостями способу оцінки показника АОС біологічного субстрату, фактично є використання кінетичних параметрів хемілюмінесценції, об'єднаних в формулі, котра дозволяє прямо кількісно визначати інтегральну АОС в конкретній пробі. Технічне рішення підвищує точність, автоматизує і зменшує кількість етапів дослідження. Принципово новим в технічному рішенні є облік інтегрального внеску гідрофільних і гідрофобних антиоксидантів в загальний показник АОСбіологічного субстрату, що підвищує точність та інформативність дослідження, в порівнянні з відомими способами. Таким чином, порівняння способу з прототипом дозволяє встановити його відповідність критерію «новизна», оскільки вперше проводиться визначення АОС біологічного субстрату з вра хуванням комплексу кінетичних параметрів хемілюміне 2 38569 Час вимірювання - 15 хвилин. Зниження АОС сироватки крові є поганим прогностичним показником і вимагає в даному випадку призначення лікувального курса антиоксидантів. Після проведення курса лікування терміном 17 діб, показник АОС в сироватці крові хворої підвищився і дорівнював 4,2 від. од., що підтверджує доцільність лікування і підтверджує інформативність даного нами способу оцінки АОС біологічного субстрату. Порівняльна оцінка дослідження АОС проведена на кафедрі сімейної медицини та поліклінічної підготовки (зав. проф. О.М. Гіріна) у хворих на ішемічну хворобу серця. При проведенні порівняльних досліджень антиоксидантної стійкості нашим способом і способом-прототипом встановлені наступні значення: Таблиця Контроль Б-ко Х-ко Г-ш Г-ко П-к Св-щ М±m Р-кнй О-ова О-ов С-ко П-ко Х-ич В-ко М-кон П-ой М±m васкуліти, підвищена ШОЕ, позитивні ревмапроби), що свідчить про активацію вільнорадикальних процесів та зниження АОС в організмі. Таким чином, визначення АОС за способом прототипу в 34% випадків дає помилкові значення цього показника, оскільки не дозволяє виявити активацію вільнорадикальних процесів в організмі, не пов'язану з ПОЛ. Це свідчить про більш високу точність оцінки АОС способом, що заявляється, по зрівнянню з прототипом і підтверджується клінічними та лабораторними даними. Таким чином, даний спосіб являє собою новий підхід до вирішення поставленого завдання - підвищення точності визначення АОС біологічного субстрату. Крім того, він має ще й інші переваги порівняно з прототипом: скорочує терміни і зменшує вдвічі кількість етапів дослідження; грунтується на прямих автоматизованих вимірюваннях показника; передбачає використання спрощеної формули з індексуванням проміжних показників і врахуванням всіх можливих варіантів, що дозволяє відразу оцінити кінцевий результат. Враховуючи важливе значення АОС в захисті організму від вільних радикалів і широке використання населенням антиоксидантних препаратів, існує висока необхідність розробки більш точних методів оцінки загальної АОС в різних тканинах організму. Наш спосіб призначений для об'єктивної оцінки стану антиоксидантної стійкості в біологічному матеріалі, отриманого в конкретного пацієнта, а також в системах in vitro, може використовуватися в широкій клінічній практиці і в науководослідних закладах з діагностичною та прогностичною метою. Групи обстежених Прототип МДА, Запропоноване мкм/л рішення AOC 0,74 5,5 0,66 6,1 0,76 6,4 0,55 6,8 0,51 5,9 0,79 5,6 0,67±0,05 6,05±0,4 Хворі ЇХС 1,52 0,81 0,64 (N) 1,2 0,72 (N) 1,9 1,14 1,36 1,16 2,4 1,24 0,9 0,75 (N) 1,13 1,37 0,91 1,12 2,1 1,32±0,3 1,41±0,3 Джерела інформації. 1. Гончаренко М.С., Лаптева А.М. Методы оценки пероксидации // Вопр. мед. химии. - 1985. – Т 31. – Вып. 3. - С. 12-23. 2. Клебанов Г.И. и др. Оценка антиоксидантной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов // Лаб. дело. - 1988. - № 5. C. 59. 3. Frее Radicals in Medicine. British Med. BuIl./Cheeseman K.N., Slater TJ.NY: Acad. Press, 1993. - 719 p. 4. Natural antioxidants in human health and disease / Balz Frei. Acad. Press: N.Y. London. Tokyo. Toronto, 1994. - P. 411-445. Як видно із таблиці, при оцінці за способомпрототипом АОС у 3-х із 9-ти хворих визначалася в межах контролю (34%). За нашим методом АОС у цих хворих була достовірно знижена, оскільки наш спосіб виявляє зміни АОС, пов'язані не тільки з перекисним окисленням ліпідів (ПОЛ), але і з окисленням білків, ДНК та інших молекул. Крім того, у цих хворих клінічне та лабораторно виявлялись ознаки запальних змін в організмі (артрити, __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3