Поживне середовище для виявлення та виділення хламідій

Поживне середовище 199 для вирощування культур з тканин, яке містить амінокислоти, вітаміни, нуклеїнові кислоти та їх похідні, вуглеводи, солі та інші компоненти, який відзрізняється тим, що для надання діагностичниї властивостей знаходження та виявлення хламідій, підвищення якості та ефективності досліджень та накопичення біомаси збудника містить вказані компоненти в такій кількості: (19) (21) 98084288 (22) 06.08.1998 (24) 15.12.2000 (33) UA (46) 15.12.2000, Бюл. № 7, 2000 р. (72) Мавров Іван Іванович, Кутова Валентина Василівна, Пустовойтова Лариса Ми хайлівна (73) УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВО-ДОСЛІДНИЙ ІНСТИТУТ ДЕРМАТОЛОГІЇ ТА ВЕНЕРОЛОГІЇ 31323 Винахід відноситься до медичної мікробіології та може бути використаний у лабораторній практиці для виявлення та виділення хламідій. Відома велика кількість синтетичних та напівсинтетичних середовищ, необхідних для вирощування культур клітин та тканин. Відповідно сучасним уявленням про обмін речовин, очевидно, що універсального середовища для виявлення та виділення хламідій не існує. Середовища, що використовуються, складні, тому що вміщують багато інши х складових, крім тих, які необхідні. Синтетичне середовище 199, впроваджене Morgan I., Morton H., Parker R., у 1950 р., має більше 60 синтетичних інгредієнтів. Це середовище широко використовується у культуральній діагностиці хламідіозів як поживне середовище для вирощування культур клітин. АМІНОКИСЛОТИ L-аланін L-аргінін L-аспаргінова к-та L-цистеїн НСІ L-цистин L-глютамінова к-та L-глютамін Гліцин L-гістидин Гідрокси-І-пролін L-ізолейцин L-лейцин L-лізин L-метіонін L-фенілаланін L-пролін L-серин L-треонін L-триптофан L-тирозин L-валін ВУГЛЕВОДИ 2-дезокси-d-рибоза d-рибоза Глюкоза СОЛІ NaCl КСІ СаСІ2 MgCl2×6Н2O MgSO4×7H2 O NaH2PO4×H2O Fe(NO3)3×9H2O NaHCO3 Так, в останні роки стало очевидним, що хламідіози людини та тварин набули широкого поширення. Тому питання спрощення стандартизації та уніфікації методів діагностичного виділення хламідій у культурі клітин набувають важливого практичного значення та потребують подальшої розробки. Відоме поживне середовище 199, прийняте нами за прототип, яке виробляється на підприємства х Росії (Інститут поліомієліту та вір усних енцефалітів. Москва. РАМІ, Катеринбургський НДІ вірусних інфекцій). Карышева А.Ф., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии. Кишинев: Штиинца, 1980. – 10 с. Прототип вміщує такі компоненти у мг/л: ВІТАМІНИ L-амінобензойна к-та Біотин Пантотенат кальцію Хлористий холін Фолієва к-та І-інозитол Нікотинова к-та Нікотинамід Піридоксаль НСІ Піридоксин НСІ Рибофлавін Тіамін НСІ Вітамін А Аскорбінова к-та Альфа-токоферолфосфат Кальциферол Вітамін К НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ ТА ЇХНІ ПОХІДНІ Аденін Гуанін НСІ Гіпоксантин Тимін Урацил Ксантин Аденілова к-та ІНШІ КОМПОНЕНТИ Оцтовий натрій Твін 80 Холестерол Глутатіон Аденозін трифосфат Феноловий червоний 50 70 60 0,1 20 150 100 50 20 10 40 120 70 30 25 40 50 60 20 40 50 0,05 0,5 1000,0 6800 400 200 200 140 0,1 2200 В основу винаходу поставлено задачу створення універсального поживного середовища для виявлення та виділення хдамідій у культурі клітин шляхом підвищення L-цистеїну-гідрохлориду з 0,1 мг/л до 2,5-3,0 мг/л, що забезпечує збільшення відсотку діагностичного виділення хламідій від людей, накопичення біомаси збудника, ефективності досліджень, що є те хнічним результатом. Авторами в процесі дослідження була встановлена можливість виділення хламідій на поживному середовищу, в якому в якості метаболіту використовується L-цистеїн-гідрохлорид. Середовище, що становить предмет винаходу, готується таким 0,05 0,01 0,01 0,50 0,01 0,05 0,025 0,025 0,025 0,025 0,01 0,01 0,10 0,05 0,01 0,10 0,01 10,0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,2 50 5,0 0,2 0,05 10 20 чином: Порошок L-цистеїну-гідрохлориду розчиняли в бідистильованій воді ex tempore в асептичних умовах та додавали до стандартного поживного середовища 199 у дозі 2,5-3,0 мг/л. На 1-2добовий монослой клітин L-929 наносили інфекційний матеріал по 0,2-0,3 мл у плоскодонні пробірки. Пробірки з матеріалом центрифугували на центрифузі з горизонтальним ротором 1 год при 400 об/хв. Після центрифугування інфекційний матеріал вилучали і заносили по 1 мл запропонованого нами поживного середовища. Інкубували при 36°С протягом 48-72 год. Облік проводили, зафар 2 31323 блюючи препарати та мікроскопуючи у світловому та люмінесцентному мікроскопах. Діагностичне дослідження інфекційного матеріалу від хворих на культурі клітин проводилося із запропонованим середовищем та з середовищем, прийнятим нами за прототип. Так, при обстеженні 17 пацієнтів із запальними хворобами урогеніталій у 5 (29,4%) хворих виявлені та виділені хламідії на запропонованому середовищі з кількістю Lцистеїн-гідрохлориду 2,5-3,0 мг/л. Приклад 1. Хворий К-в А.Н., і.х. № 1013, 44 роки, знаходився на лікуванні у відділенні венерології УНДІДІВ з 08.10.1997 до 16.10.1997 з приводу хронічного негонококового уретриту, паренхіматозного простатиту. Вважає себе хворим близько 7 років. Результати бактеріоскопічних, серологічних обстежень на хламідії - негативні. При дослідженні інфекційного матеріалу з уретри на культурі клітин з використанням запропонованого середовища за № 83 від 13.10.1997, виявлені та виділені хламідії. У паралельній пробі з середовищемпрототипом хламідії у к ультурі тканин не виявлені. Простежено якість та ефективність дослідів, збільшення накопичення біомаси збудника на культурі клітин з урогенітальними штамами L-2 та UG-C. Приклад 2 Таблиця Накопичення біомаси збудника у пасажах Середовище перв. І Прототип Запропоноване 9,89 51,64 6,15 69,0 Відсоток уражених хламідіями клітин пасажі ІІ ІІІ перв. І штами L2 ІІ ІІІ 13,73 62,50 3,02 73,84 UG-C 4,16 68,11 4,28 68,35 Наведені у таблиці дані свідчать про те, що використання запропонованого середовища значно збільшує відсоток уражених хламідіями клітин L-929 (5-6 разів) порівняно з прототипом, що значно впливає на накопичення біомаси хламідій як у первинних, так і у наступних пасажах з подальшим застосуванням біомаси для одержання та очищення антигену, вивчення біохімічних та морфологічних властивостей зб удника. Крім того, запропоноване середовище сприяє скороченню строків циклу розвитку хламідій з 72 24,39 81,49 9,47 73,56 до 48 год, що призводить до скорочення строків лабораторної діагностики. Впровадження запропонованого середовища в практику лабораторій шкірно-венерологічних, акушерсько-гінекологічних, педіатричних та урологічних закладів для виявлення та виділення хламідій буде сприяти уніфікації досліджень та отриманню економічного ефекту. Таким чином, запропоноване рішення відповідає критерію "промислове застосування", оскільки може бути використане усюди для діагностики хламідійної інфекції. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 35 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3