Спосіб отримання антигрипозної сиворотки

Изобретение относится к вирусологии и иммунологии и может быть использовано для идентификации штаммовой принадлежности вирусов гриппа. Цель изобретения - упрощение способа. Изобретение относится к вирусологии и иммунологии и может быть использовано для идентификации штаммовой принадлежности выделенных из разных источников вирусов гриппа, новых штаммов вируса гриппа, определения степени антигеннего родства штаммов, расшифровки этиологии эпидемий гриппа и диагностики гриппа. Цель изобретения - повышение специфичности антигриппозной сыворотки за счет получения штаммоспецифической сыворотки. Способ осуществляется следующим образом. Белых беспородных крыс иммунизируют облученным ультрафиолетовыми лучами в энергетической дозе 450042-90 Цель достигается тем, что в качестве продуцентов иммуной сыворотки используют белых беспородных крыс, предварительно отбираемых по отсутствию в сыворотке группозньгх антигемагглютининов и неспецифических ингибиторов, а в качестве иммуногена используют очищенную и сконцентрированную путем сорбции-элюции на куриных эритроцитах или ульрацентрифугирования взвесь вируса, инактивированную ультрафиолетовыми лучами. При этом крыс иммунизируют внутрибрюшинно иммуногеном с гемагглютпнирующей активностью (1 : :1024)-(1:2048) дважды с интервалом 6-8 дней, а через 20-52 дня от начала иммунизации отбирают иммунную сыворотку. 4 табл. 2 5400 Дж/м вирусом гриппа с гемагглютинирующей активностью 1:1024 и выше в объеме 1,0 мл внутрибрюшинно дважды, с интервалом 6-8 дней, а сыворотку отделяют через 20-22 дня. Способ осуществляется следующим образом. Для иммунизации отбирают белых беспородных крыс массой тела 180-220 г путем исследования крови на содержание гриппозных антигемагглютининов и неспецифических ингибиторов в реакции торможения гемагглютинации с вирусом гриппа. Иммунизируют только тех животных, в крови которых отсутствуют неспецифические ингибиторы и гриппозные антигемагглютинины. Затем получают гриппозный иммуиоген. Для этого о СП 1607577 Титры штаммоспецифической антигриппозной сыворотки в зависимости от дозы вируса и сроков получения сыворотки приведена в табл. 2. с Снижение дозы вируса до (1:512)(1:256) приводило к выраженному снижению титров целевого продукта. Однократная иммунизация даже завышенной і о дозой вируса не обеспечивала получения достаточно высоких титров. У другой группы животных, иммунизированных вирусом в дозе (1:1024)-(1:2048), получали сыворотки в более ранние и 15 более поздние сроки. На 17-19 день титры антигриппозных сывороток были существенно ниже, чем на 20-22 день. На 23-30 день титры сывороток существенно не изменялись. Таким образом, 20 техническими параметрами способа являются: доза вируса для иммунизации равна 1,0 мл, гемагглютииирующая акП р и м е р 1. Аллантоисную культутивность 1:1024 и выше двукратно, а ру штамма вируса гриппа А (Филиппины) срок отбора антигриппозной сыворот2/82 (НЗ 2) очистили и сконцентрировали методом сорбции - элюции на кури- 25 ки - 20-22 день от начала иммунизации. ных эритроцитах до титра гемагглютиниП р и м е р 2. Сыворотки крови 4 рующей активности 1:1024 . Инфекционбелых беспородных крыс исследованы ный титр равен 1:10000. Взвесь вируса в реакции торможения гемагглютинации толщиной слоя 1,0 мм в чашках Петри с вирусом гриппа. Во всех сыворотках облучили разными дозами (от 2700 до 30 в разведении 1:20 и выше отсутство6750 Дж/м 2 ) ультрафиолетовых лучей вали гриппозные антигемагглютинины прд ртутно-кварцевой лампой ПРК-7. и неспецифические ингибиторы. Методом Энергетическая доза облучения опредесорбции-элюции на куриных эритроцитах лена с помощью автоматического дозиочищена и сконцентрирована аллантоисметра ДАУ-81. ная культура штамма вируса гриппа 3 5 В/Киев/663/84 до титра гемагглютиниДинамика инфекционных и гемагглютирующей активности 1:2048 . Затем взвесь нирующих свойств вируса гриппа в завивируса облучали ультрафиолетовыми лусимости от дозы ультрафиолетового о б 2 чами в дозе 45П0 Дк/м под лампой лучения приведена в т а б л . 1. РПК-7. Крыс иммунизировали по предI 40 лагаемому способу. Полученные сыворотМинимальная энергетическая доза обки исследовали на наличие штаммоспелучения, вызывающая полную инактивацифических антител. Во всех сыворотцию инфекционности вируса, составляках выявлено содержание антител к ет 3600 Дж/м 2 . Максимальная доза, не •тамму В/Киев/663/8А в титрах вызывающая снижения гемагглютинирующе-45 (1;280)-(1:640). Антигриппозная сыво2 го титра, составляет 5850 Дж/м , Таротка была исследована со штаммами ким образом, облучение вируса ультравируса гриппа, циркулировавшими до и фиолетовыми лучами в дозе 4050после появления В/Киев/663/84. 5400 Дж/м 2 обеспечивает полную инактивацию инфекционности вируса при пол- 5 о ном сохранении его гемагглютинирующих Дифференциация антигриппозной сы* свойств. Эта доза получена на расстоявороткой штаммов вируса гриппа привении 45-50 см от лампы за 2,5-3 мин. дена в табл. 3. Приготовленным таким образом вируТаким образом, полученная антисом гриппа с различной гемагглютяни- ^5 гриппозная сыворотка В/Киев/663/84 рующей активностью проиммунизированы четко дифференцирует штамм В/Киев/ по предлагаемому способу белые беспо/663/84 от других штаммов. родные крысы и получены антигриппозСопоставлена специфичность антиные сыворотки. гриппоэных сывороток, приготовленных аллантоискую культуру вируса гриппа очищают и концентрируют методом сорбции - элюции на куриных эритроцитах или ультрацентрифугирования до титра гемагглютинируюгаей активности 1:1024 и выше и помещают в чашки Петри таким образом, чтобы толщина слоя равнялась 1,0 мм. Чашки облучают ультрафиолетовыми лучами в энергетической дозе 4500-5400 Дж/м2 (под ртутно-кварцевой лампой ПРК-7 на расстоянии 45-50 см от центра лампы 2,5-3 мин). Полученным таким образом вирусом с инактивированной инфекционностью иммунизируют белых беспородных крыс внутрибрюшинно в объеме 1,0 мл дважды с интервалом 6-8 дней. Затем через 20-22 дня проводят забор крови и отделяют щтаммоспецифическую антигриппозную сыворотку. і 6 1607577 ганизме животных, отрицательно влияюпо предлагаемому и по известному спощей на специфичность сыворотки. Дозисобам. Антигриппозная сыворотка рование вируса (иммуногена) повышает В/СССР/100/83, приготовленная по стабильность качества целевого продукизвестному способу, не дифференцирую' та. Сокращение кратности (н 6-12 раз) ет штаммы В/Гонконг/5/72, В/Сингапур/ и длительности (на 0,5-2 месяца) имму/222/79, Б/СССР/100/83. Антигриппознизации также повышает специфичность ная сыворотка В/СССР/100/83, приготовленная по предлагаемому способу, чет- антигриппозной сыворотки, ускоряет IQ получение и уменьшает стоимость целеко дифференцирует все штаммы. вого продукта. Помимо этого, по сравСпецифичность антигриппозных сывонению с известным способом предлагаероток, приготовленных предлагаемым мый способ более эффективен по основи иэв'естным способами, приведена в ному показателю - специфичности, то табл. 4, По предлагаемому способу пригото- , 5 есть штаммоспецифичностыо антигриппозвили антигриппозиые' сыворотки В/Синнои сыворотки, которая дает возможгапур/222/79, В/СССР/100/83, В/Энн ность, в отличие от известных, идентиАрбор/1/86, В/Виктория/3/85 и В/Киев/ фицировать не только род и серотип /663/84. С их применением была провевирусов, но и их штаммовую прпнадлеждена штаммовая идентификация 37 куль- 20 ность. Применение предлагаемого спосотур вируса гриппа, выделенных во вреба для расшифровки этиологии эпидемя эпидемии гриппа. В 1986 г. 33 вимий гриппа дает возможность получить руса были идентифицированы как В/Викконкретные вирусологические данные о торкя/385, 3 вируса - В/Энн Арбор/1/ штаммовой структуре популяции вируса, /86 и 1 вирус - как новый штамм В/Ки- 25 необходимые для этиологического проев/690/86. гноэирования эпидемического процесса, Таким образом, полученная по предсоставления научно обоснованных реколагаемому способу антигриппозная сьгаоменлаций по обновлению штаммового ротка пригодна для штаммовой идентисостава вакцин и диагностикумов, поэфикации вирусов гриппа, в отличие от зо воляет идентифицировать новые штаммы вируса. сыворотки, полученной по известному Предлагаемый способ может широко способу. Приготовленные по предлагаемому способу антигриппозные сыворотки применяться для диагностики гриппа позволили идентифицировать штаммовую и для исследовательских целей. принадлежность возбудителей эпидемии 35 гриппа в 1986 г. и выявить новый Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я штамм. По сравнению с другими- животными Способ получения антягриллозной белые беспородные крысы являются предсыворотки, включающий иммунизацию крыс почтительным продуцентом антигриппоз- 4 0 вирусом гриппа и отделение иммунной ной сыворотки с учетом требований досыворотки, о т л и ч а ю щ и й с я ступности и стоимости животных и их тем, что, с целью повышения специфичсодержания, устойчивости к болезням, ности за счет получения штаммоспецинеприхотливости к кормам, большей фической сыворотки, белых беспородных чистоты сывороток в отношении неспе- 45 крыс иммунизируют облученным ультрафиолетоБыми лучами в энергетической цифических ингибиторов. Применение дозе 4500-5400 Лд/м2 вирусом гриппа для иммунизации вируса с инактивирос гемагглютинирующей активностью і ванной инфекциончостью исключает возможность перекрестного инфицирования 1:1024 и выше в объеме 1,0 мл, продуцентов, что упрощает и удешевля- 50 внутрибрюшинно дважды, через 6-8 дней ет их содержание, а также исключает последующим через 20-22 дня отделес возможность репродукции вируса в орнием сыворотки. Т абл н ц а 1 1 Показатели Бируса при энергетической дозе облучения, Дж/м Титр вируса 2700 [Інфекционньїй Гемяпмдатнннрующий 3150 1:10000 Т:Ю0 1:102А 1:1024 1 3600 і 4050 4500 | 4950 | 5400 5850 1 6300 0 0 0 0 0 0 0 1:1024 1:1024 1:1024 1:1024 1:1024 1:512 0 I 6750 0 0 607577 Т а блиц а 2 Гемагглютинирующая активность вируса Количество антигриппозных сывороток с титрами 1:40 1:160 ! і 3 10 6 1 : 80 6 2 1 (1:1024)-(1:2048) 1:4096 и выше Однократная иммунизация (1:4096) Сроки отбора антигриппозной сыворотки 17-19 день 20-22 день 23-30 день :32О [ 1: 640 20 24 4 10 4 24 14 и выше Всего 20 7 14 56 29 J5 56 20 Т а б л и ц а З Штаммы Титры антигриппозной сыворотки В/Киев/663/84 В/Киев/663/84 В/Сингапур/222/79 В/СССР/100/83 В/Виктория/3/85 В/Энн Арбор/1/86 1:280