Спосіб культивування вірусів гепатиту с

Спосіб культивування вірусів гепатиту С, що включає культивування на суспензійних культурах клітин, який відрізняється тим, що як суспензійну культуру клітин використовують трансфековану кДНК-ВГС культуру МТ-4. (19) (21) u200900923 (22) 06.02.2009 (24) 25.03.2009 (46) 25.03.2009, Бюл.№ 6, 2009 р. (72) РИБАЛКО СВІТЛАНА ЛЕОНТІЇВНА, UA, ПОРВА ЮЛІЯ ІВАНІВНА, UA, ДЯДЮН СВІТЛАНА ТЕРЕНТІЇВНА, UA, ЗАВЕЛЕВИЧ МИХАЙЛО ПЕТРОВИЧ, UA, БОРОВІКОВ ВАДИМ МИХАЙЛОВИЧ, UA, ФЕДОРЧЕНКО ДАР'Я БОРИСІВНА, UA, АЛЕКСЕЄНКО ІВАН ПРОКОПОВИЧ, UA, ЖАРКОВА ЛЮДМИЛА ДМИТРІВНА, UA (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ 3 40311 4 Останню відмивку аналогічно попереднім процію здійснюють при 37°С протягом 30 хв., в реводять в ацетоні (400 мкл). Повністю видаляють зультаті чого отримують к ДНК. супернатант із кожної пробірки. Осад підсушують в Трансфекцію суспензійних культур МТ-4 здійствердотільному термостаті «Біоком» (Росія) при нюють кальцій-фосфатним методом [6]. Ізотонічтемпературі 60°С протягом 10 хвилин. ний розчин, що містить буфер HEPES, фосфат і Елюцію РНК проводять в 50 мкл деіонізованої ДНК змішують з хлористим кальцієм. Утворюється води, що не містить РНКаз. Інкубують в термостаті осад із часток фосфату кальцію та ДНК, розмір при 60°С протягом 3 хв. Супернатант містить очияких лежить в нанометровому діапазоні. Суспенщену РНК. Проби готові до постановки реакції зію додають до культури клітин, які поглинають зворотної транскрипції і ПЛР. частки. Далі отримують кДНК. Реакцію зворотної Готовлять розчини: А - HEPES - рН 7,1 - 300 транскриптази РНК проводять у відповідності до мкл; В - 2 М СаСl2 - 300 мкл. Для приготування рекомендацій фірми виробника за допомогою комрозчину В до 36 мкл СаСl2 додають 20 мкг кДНК плекту реагентів «Реверта-L» (ФГУН «ЦНДІЕ» РоHCV і доводять дистильованою водою до 300 мкл. спотребнагляду, Москва), який призначений для Потім розчин А по краплям додають до розчину В, отримання кДНК по матриці РНК збудників інфекпродувають повітря і витримують 30 хв. при кімнаційних хвороб для наступного аналізу методом тній температурі до утворення осаду. Отриманий полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). осад по краплям додають в культури клітин МТ-4. Матеріалом для дослідження слугує розчин Культури трансфекованих к ДНК вірусу гепатиту С РНК, виділений з використанням комплексу реагеінкубують при температурі 36,5°С в термостаті з нтів «РИБО-сорб» (ФГУН «ЦНДІЕ» Роспотребнагподачею 5% СО2. Тестування вірусу здійснюють ляду, Москва). методом ПЛР на 2-му пасажі на 9-у добу культивуРеакційна суміш складається з DTT ліофілізовання та на 5-му пасажі на 17 добу культивування. ваного, 125 мкл розчину RT-mix та 6 мкл ревертаПриклад 2. Результати визначення продукції зи (MMLV). До 10 мкл готової реакційної суміші вірусу гепатиту С подані в таблиці 1. додають 10 мкл РНК-проби. Зворотну транскрипТаблиця 1 Культивування кДНК ВГС в культурі клітин МТ-4 №№ п/п 1 2 3 4 5 Вихідне вірусне навантаження (г/екв.) 328 540 176 351 221 335 165 225 124 176 1-й пасаж, 9-й день культивування (г/екв.) 133 164 19 440 84 888 237 168 459 756 Після 30 діб культивування продукуючих культур клітин МТ-4, трансфекованих вірусом гепатиту С, їх заморожують у рідкому азоті. За 24 години до заморожування клітинної лінії ростове середовище (RPMI-1640 + 10 % фетальної сироватки) замінюють на підтримуюче середовище (RPMI-1640 + 2% фетальної сироватки). Клітини знімають версеном, ресуспендують в поживному середовищі, підраховують в камері Горяєва та відмічають їхню життєздатність (за допомогою 1% розчину трипанового синього). Клітини заморожують, якщо їх життєздатність переви 5-й пасаж, 17-й день культивування (г/екв.) 108 098 22 385 118 291 285 415 472 156 щує 90%, для чого їх сконцентровують шляхом центрифугування. Для заморожування використовують як кріопротектор диметилсульфоксид (ДМСО), який вносять в попередньо охолоджену клітинну суміш. Потім клітини переносять у рідкий азот. Через 1 місяць продукуючі МТ-трансфековані ВГС культури розморожують та культивують в термостаті при температурі 36,5°С з подачею 5% СО2. Результати визначення продукції вірусу гепатиту С подані в таблиці 2. Таблиця 2 Культивування кДНК ВГС в культурі клітин МТ-4 (після розморожування) №№ п/п 1 2 3 4 5 На 5-й день культивування (г/екв.) 309 784 51 916 828 240 658 326 545 988 На 30-й день культивування (г/екв.) 127 978 31 659 616 622 517 085 520 312 5 40311 Таким чином, одержані продукуючі культури клітин, трансфековані кДНК ВГС, які дають стабільну продукцію вірусу гепатиту С як до заморожування трансфекованих клітин МТ-4, так і після розморожування. Література. 1. Hepatitis C Like Viruses // International Committee on Taxonomy of Viruses. 6-th Report. - New York, 1977. - P. 424. 2. Choo Q.-L., KuoG., Weiner A.I. et al. // Seience. - 1989. - Vol. 244. - P. 359-362. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков 6 3. Qn D., Hahtz O., Goug M. Et al. // J. Gen Virol. - 1994. - Vol. 75. - P. 1063-1070. 4. Carloni G., Lacovacci S., Sargiacomo M. et al. // Arch. Virol. - 1993. - Suppl. - № 8. - P. 31-39. 5. Mizutani Т., Kato N., Ikeda et al. Characterization of hepatitis С vims replication in cloned cells obtained from a human T-cell leukemia virus type 1infected cell line, MT-2 // J.virol. - 1996. - 70. P.7219-7223. 6. Graham F.L., van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. / Virology, 1973, 52 (2), P. 456-467. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601