Спосіб культивування первинних клітин та ампліфікації вірусів в умовах безсироваткового середовища, композиція та її застосування та спосіб лікування або вакцинації тварини

1. Спосіб ампліфікації вірусу, котрий включає етапи: культивування первинних пташиних клітин в безсироватковому середовищі, яке містить фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту (EGF) та фактори адгезії (FN) , інфікування первинних пташиних клітин вірусом, культивування інфікованих клітин в безсироватковому середовищі до одержання вірусного покоління, де первинні пташині клітини є клітинами, що забезпечують ефективну реплікацію вірусів. 2. Спосіб згідно з пунктом формули 1, де первинні пташині клітини є курячими ембріональними фібробластами (CEF). 3. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів формули 1, 2, де фактор росту є епідермальним фактором 2 (19) 1 3 85543 4 16. Спосіб згідно з пунктом формули 15, де вірус коров'ячої віспи є модифікованим вірусом коров'ячої віспи Ankara. 17. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів формули з 14 по 16, де поксвірус є ослабленим або рекомбінантним вірусом. 18. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів формули з 1 по 17, де безсироваткове середовище в одному або обох з етапів: інфікування первинних пташиних клітин вірусом та культивування інфікованих клітин в безсироватковому середовищі до одержання вірусного покоління не має факторів, вибраних з-поміж факторів росту та факторів адгезії. 19. Спосіб згідно з будь-яким з пунктів формули з 1 по 18, де за етапом культивування інфікованих клітин в безсироватковому середовищі до одер жання вірусного покоління виконують один або більше етапів очищення. 20. Композиція, яка включає поксвірус, одержаний способом згідно з будь-яким з пунктів формули з 1 по 19. 21. Композиція за пунктом 20, яка є такою, що не містить будь-яких продуктів та/або інфекційних чинників, що містяться в тваринній сироватці. 22. Композиція згідно з пунктами формули 20 або 21 як ліки або вакцина. 23. Застосування композиції, згідно з пунктами формули 20 або 21, для виробництва вакцини. 24. Спосіб лікування або вакцинації тварини, включаючи людину, за їхньої потреби в цьому, який включає введення композиції, як визначено в будь-якому з пунктів формули з 20 по 21, тварині або людині. Даний винахід стосується способу культивування первинних клітин. Первинні клітини культивують в безсироватковому середовищі, яке містить фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії. Спосіб культивування первинних клітин може бути одним з етапів в способі ампліфікації вірусів, таких як поксвіруси. Згідно останнього способу, первинні клітини культивують в безсироватковому середовищі, яке містить фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії. Потім клітини інфікують вірусом та інфіковані клітини культивують в безсироватковому середовищі до отримання вірусного потомства. Більшість вірусних вакцин, таких як ослаблені або рекомбінантні вакцини виробляють з клітиннокультуральних систем. Клітини, які використовують для одержання вірусу/вакцини можуть бути клітинними лініями, тобто, клітин, які постійно ростуть in vitro, та в умовах суспензійної культури окремих клітин в біореакторі або як моношару на підтримуючій клітини поверхні в культуральних колбах або ролер-флаконах. Деякими прикладами таких клітинних ліній, які використовувалися для продукування вірусів є: ембріональна легенева клітинна лінія людини MRC-5, яка використовувалася для продукування поліовірусів й ембріональна легенева клітинна лінія людини WI-38, яка використовувалася для продукування вірусів кору, вірусу паротиту та вірусу краснухи (MMR II) (Merk Sharp & Dohme). Не лише клітинні лінії, але й, також, первинні тваринні клітини використовувалися для продукування вакцин. Прикладом первинних клітин, котрі використовувалися для продукування вірусів є фібробласти курячого ембріону (CEF-клітини). Ці клітини використовувалися для продукування вірусів кору та японського енцефаліту (Pasteur Merieux), вірусу паротиту (вироблено Provaccine), вірусу сказу (виробництва Chiron Berhing GmbH & Co.), вірусу жовтої лихоманки (виробництва Aprilva x), вірусу грипу (виробництва Wyeth Labs та SmithKline & Beecham) та модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara (MVA). CEF-клітини часто використовуються, оскільки багато вірусних вакцин виробляється шляхом ослаблення вірулентних вірусів, які спричиняють хворобу, шляхом послідовних пасажів CEF-клітин. Ослаблений вірус більше не може спричинити хворобу, але все ще здатний стимулювати потенційну захисну імунність проти вірулентної форми вірусу. Прикладом такого типу вірусу є MVA. Цей вірус має значні обмеження реплікації у людей та у більшості тварин. MVA було розроблено як вакцинний вектор, оскільки він міг використовуватисядля експресії антигенів, одержаних з різноманітних агентів, які спричиняють захворювання людей. Ослаблені віруси, такі як MVA, переважно, не вирощують на людських клітинах, оскільки є занепокоєння тим, що віруси можуть знову стати реплікаційно компетентними в клітинах, які походять від людини. Однак, віруси які повернули здатність до реплікації в клітинах людини, можуть становити загрозу здоров'ю при введенні людині, зокрема, якщо особа має ослаблений імунітет. З ци х міркувань, деякі ослаблені віруси, такі як MVA, виробляються лише на CEF-клітинах, якщо призначаються для введення людям. Крім того CEF-клітини використовуються для тих вірусів, котрі ростуть лише на вказаних клітинах. Прикладами таких вірусів є, зокрема, пташині віруси, такі як пташині поксвіруси, зокрема, AL VAC, поксвірус канарки, поксвірус домашніх птахів та NYVAC. Клітинні лінії та первинні клітини, вирощені за умов культивування in vitro, потребують спеціального ростового та підтримувального середовища котре може підтримувати (І) клітинну реплікацію в логарифмічній фазі та (II) зберігання клітин, коли клітини вже не поділяються, тобто, коли клітини знаходяться в стаціонарній фазі. Клітинні культуральні середовища, котрі зазвичай використовуються, являють собою багаті на солі розчини, які містять вітаміни, амінокислоти, необхідні мікроелементи та цукри. Звичайно вводяться як добавки до середовищ гормони росту, ферменти, та біологічно активні протеїни у формі сироваткових продуктів, одержаних з тваринної крові, котрі є 5 85543 необхідними для підтримування росту клітин та їхнього зберігання. Прикладами сироваткових продуктів, одержаних з тваринної крові, є ембріональна теляча сироватка, куряча сироватка, кінська сироватка та свиняча сироватка. Ці сироватки одержані з фракціонованої крові, з якої були видалені червоні та білі кров'яні клітини. Первинні клітини, такі як CEF-клітини, є ще значно більш залежні від джерел тваринної сироватки ніж клітинні лінії. Отже, первинні клітини, зазвичай культивуються в клітинному культуральному середовищі, котре містить від 5 до 10% сироватки, в більшості випадків ембріональну телячу сироватку (FCS). Тваринна сироватка містить не лише фактори необхідні для росту клітин, але також фактори, необхідні для клітин, котрі звичайно ростуть прикріпленими до поверхні, яка підтримує клітини в культуральній посудині. Отже, для адгезивних клітин є критичним додавання достатньої кількості сироватки в середовище для того щоб клітини могли утворити моношар. На жаль, бичача/ембріональна теляча сироватка, як і сироватки інших тварин, можуть містити випадкові патогени, такі як віруси. Існує потенціальна загроза, того що ці патогени передадуться тварині/людині, яка буде лікуватися або вакцинуватися вакциною або будь-яким іншим фармацевтичним виробом, одержаним з клітинної культури. Це має ще більше значення, коли продукти клітинної культури вводяться людям з ослабленим імунітетом. Однією з багатьох важливих потенційних проблем, пов'язаних з широко застосовною добавкою з бичачої сироватки, є можливість передачі збудника губчастого енцефаліту корів (BSE) тваринам/людям, які контактували з продуктами, одержаними з клітинних культур. У зв'язку з потенційним ризиком, пов'язаним із використанням тваринної сироватки в клітинній культурі стає зрозумілим, що є велика потреба у виробничих процесах, в яких не використовуються тваринні продукти. Для цього були розроблені специфічні середовища, до яких не додаються тваринні сироватки, для безперервно ростучих клітинних ліній, та для одержання вірусів в безперервно ростучи х клітинних лініях, відповідно. Прикладом таких безсироваткових середовищ, які можуть застосовуватись для культивування клітинних ліній є середовище VP-SFM, яке виробництва Gibco BRL/Life Technologies. Згідно інформації виробника VP-SFM розроблено спеціально для вирощування VERO, COS-7, MDBK, Нер2, ВНК-21 та інших важливих клітинних ліній (Price, P. and Evege, E. Focus 1997, 19: 67-69) та для одержання вірусів у вказаних клітинних лініях. Немає ніякої інформації стосовно культивування первинних клітин на вказаному середовищі. В US 5,503,582 описано культивування CEFклітин в середовищі, яке містить 4% телячої сироватки після інфікування клітин пташиним поксвірусом в безсироватковому середовищі. Spataro, А.С. et al., J. Cell. Sci. 1976; 21, 407-413 описують, що CEF-клітини можуть підтримуватися на безсироватковому середовищі до утворення моношару. Отже, згідно обох публікацій, середовища, які вико 6 ристовувалися для культивування клітин, після висівання містили сироватку. Безсироваткове середовище використовувалося лише для підтримування клітин, котрі вже прикріпилися до поверхні та досягли стаціонарної фази. Якщо висівання виконувалося на звичайні середовища, такі як 199 або RPMI-1640, без сироватки, моношар не утворювався й клітини утворювали нежиттєздатні скупчення в середовищі. У WO 98/15614 наведено специфічне безсироваткове середовище для культивування in vitro тваринних клітин. Клітини, котрі можуть культивуватися в середовищі описаному в WO 98/15614 є клітинами тваринного походження, включаючи клітини, одержані від ссавців, птахів, комах та риб. Клітини ссавців можуть бути первинними клітинами, людського походження. Не було зроблено повідомлень про первинні клітини птахів. В US 5,405,772 описано безсироваткове середовище для проліферації та розвитку клітин. Клітини є, переважно, гематопоетичними клітинами й клітинами строми кісткового мозку. Про первинні пташині клітини не зазначено. У WO 98/04680 описано безсироваткове середовище для вирощування залежних від закріплення на підложці клітин ссавців, таких як клітини ВНК, Vero або MRC-5. У WO 98/04680 не зазначаються ані первинні клітини, ані пташинні клітини. Об'єктом даного винаходу є створення способу, що дозволяє культивувати первинні клітини, зокрема, первинні пташині клітини, в безсироватковому середовищі, де спосіб дозволяє (І) вирощувати клітини в логарифмічній фазі та (II) зберігати клітини в стаціонарній фазі. Також, якщо клітини є адгезивними клітинами, середовище може, бажано, дозволяти (III) приєднання адгезивних клітин до поверхні культуральної посудини. Наступним об'єктом даного винаходу є створення способу одержання вірусу з використанням первинних клітин в умовах безсироваткового середовища. Даний винахід пропонує спосіб культивування первинних клітин, який відрізняється тим, що клітини культивуються в безсироватковому середовищі, яке включає фактор вибраний з групи яка містить фактори росту та фактори адгезії. Згідно даного винаходу первинні клітини, які зазвичай ростуть як адгезивні клітини, приєднуються до поверхні культуральної посудини після висівання й ростуть в логарифмічній фазі до утворення моношару. Згідно даного винаходу, клітини, які в даний час не використовуються, можуть підтримуватися в середовищі, яке використовувалося при прикріпленні й логарифмічному рості клітин. Спосіб даного винаходу не обмежується клітинами, які утворюють моношари. Згідно альтернативного втілення, спосіб згідно даного винаходу, може бути використаний для всіх інши х типів первинних клітин, таких як клітини, що ростуть зазвичай, у суспензійній культурі (наприклад, лімфоцити або інші типи кров'яних клітин) або клітини, що зазвичай, можуть рости як адгезивні клітини, але були адаптовані для росту в суспензійній культурі. Як показано нижче, клітини можуть також бути використані для безсироваткової ампліфікації вірусів, котрі можуть бути корисними як вакцини. 7 85543 Було неочікуваним, що первинні клітини, що зазвичай ростуть як адгезивні клітини (І) можуть ефективно приєднуватися до поверхні культуральних посудин без утворення небажаних агрегатів та (II) можуть вирощуватись в логарифмічній фазі у відсутності сироватки, оскільки раніше вважалося, що первинні клітини є залежними від множини різних факторів та компонентів, які містяться в сироватці. Більш того, вважалося, що адгезивні клітини утворюють нежиттєздатні агрегати, котрі не приєднуються до поверхні культуральних посудин, коли культивуються в безсироватковому середовищі. Отже, було неочікуваним, що буде достатнім додати до безсироваткового середовища фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії для досягнення прикріплення та росту адгезивних первинних клітин. Більш того, також було неочікуваним, що культивовані в суспензійній культурі первинні клітини можуть вирощува тись на середовищі, використаному в способі, згідно даного винаходу. Більш того, було неочікуваним, що первинні пташині клітини, такі як ембріональні курячі фібробласти (CEF), можуть культивуватися приєднанням до поверхні культуральних посудин без утворення небажаних агрегатів в безсироватковому середовищі, яке містить фактори, вибрані з групи яка включає фактори росту та. фактори адгезії, оскільки було відомо, що пташині клітини надзвичайно погано ростуть на безсироватковому середовищі, яке не містило фактори росту та фактори адгезії, тобто, було неочікуваним, що погані ростові властивості первинних пташиних клітин будуть значно поліпшені додаванням до безсироваткового середовища факторів, вибраних з поміж факторів росту та факторів адгезії. Термін "первинні клітини", як застосовується в даному описі, є добре відомим особі, досвідченій в даній галузі. Не обмежуючись наступним визначенням, термін "первинні клітини" стосується клітин, котрі щойно було виділено з тварини або людської тканини, органу або організму, коли клітини нездатні постійно або нескінченно реплікуватися та ділитися. Звичайно, первинні клітини поділяються в клітинній культурі менше ніж 100 разів, часто менше ніж 50 разів, часто менше ніж 25 разів. Отже, первинні клітини не переживають іморталізацію. Прикладами первинних клітин є лімфоцити пуповинної крові та фібробласти людини або тварини. Переважними прикладами тваринних фібробластів є пташині фібробласти, більш бажано, фібробласти курячого ембріону (клітини CEF). Переважним прикладом первинних фібробластів людини є фібробласти крайньої плоті людини. Способи виділення первинних клітин є добре відомими особі, досвідченій в даній галузі. Взагалі, культури первинних клітин є прямо одержаними з тканин, органів та ембріонів. Тканини, органи або ембріони обробляються протеазами для одержання відокремлених клітин. Потім клітини культивують згідно зі способом за даним винаходом в умовах к ультивування in vitro. Більш докладно, CEF-клітини одержані з оброблених протеазами курячих ембріонів. Згідно даного винаходу, CEF-клітини краще ростуть як 8 адгезивні клітини, приєднані до твердої підложки, що підтримує клітини. Клітини починають реплікуватися й утворюють моношар. Якщо CEF-клітини (після лізису ембріону) культивуються in vitro в стандартному культуральному середовищі без тваринної сироватки, клітини іноді пристають до твердої поверхні, але не реплікуються утворюючи цільний моношар клітин і з часом повільно відокремлюються від твердої культуральної поверхні. На противагу, якщо CEF-клітини культивуються згідно способу даного винаходу, клітини приєднуються до твердої поверхні, ростуть в логарифмічній фазі до утворення моношару й можуть підтримуватися в стаціонарній фазі протягом декількох днів. Термін "культивування клітин" в безсироватковому середовищі в контексті адгезивних первинних клітин стосується висівання клітин в культуральну посудину на безсироваткове середовище, до росту клітин в безсироватковому середовищі в логарифмічній фазі до утворення моношару та/або підтримування клітин в безсироватковому середовищі з моменту утворення моношару. Більш переважно, термін "культивування клітин" в безсироватковому середовищі стосується методу, в якому всі, згадані вище етапи, виконані в безсироватковому середовищі, таким чином, що під час всього процесу культивування клітин не застосовується жоден сироватковий продукт. Отже, в більш загальному розумінні термін "культивування клітин в безсироватковому середовищі" стосується того факту, що всі середовища, які призводять до утворення моношару є безсироватковими середовищами. Середовища, що використовуються в усіх вище названих етапах можуть включати фактор вибраний з факторів росту та факторів адгезії. Хоча, може бути достатнім, додавання такого фактору лише в середовища, що використовуються для адгезії клітин та/або росту клітин за логарифмічних умов. Термін "культивування клітин" в безсироватковому середовищі в контексті клітин, які вирощують в суспензійній культурі стосується висівання клітин в культуральну посудину в безсироваткове середовище, вирощування клітин в безсироватковому середовищі в логарифмічній фазі та/або зберігання клітин в безсироватковому середовищі з моменту досягнення максимальної щільності популяції, при котрій реплікація вже не відбувається. Більш переважно, термін "культивування клітин" в безсироватковому середовищі стосується способу, в котрому в безсироватковому середовищі виконано всі вище згадані етапи, таким чином, що при всьому процесі культивування клітин нема жодних сироваткових продуктів. Середовище, яке використовувалося в усі х раніше згаданий етапах, бажано, може містити фактор, вибраний з групи факторів росту. Однак, може бути достатнім додавання такого фактору лише в середовище, яке використовується для висівання клітин та/або вирощування за логарифмічних умов. Як нижче більш детально пояснено, також може бути можливим культивувати клітини, котрі можуть нормально рости як адгезивні клітини, також в суспензійній культурі клітин, якщо підібрано відповідні умови культивування 9 85543 (наприклад, застосування "хвильового" інкубування). Спосіб згідно даного винаходу також, відноситься до цього типу інкубування. Термін "безсироваткове" середовище стосується будь-якого клітинного культурального середовища, котре не містить сироваток людського або тваринного походження. Придатні клітинні культуральні середовища відомі особам, досвідченим в даній галузі. Ці середовища містять солі, вітаміни, буфери, джерелі енергії, амінокислоти та інші речовини. Прикладом середовища, придатного для безсироваткового культивування CEF-клітин є середовище 199 (Morgan, Morton and Parker; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1950, 73, 1; котре можна одержати у Life Technologies). Середовища, які використовуються, згідно способу даного винаходу, зокрема середовища, використані для адгезивних клітин, таких як CEFклітини, містять фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії. Прикладом такого фактору адгезії є фібронектин. Для клітин, котрі звичайно можуть рости як адгезивні клітини, але тим не менш, культивуються в суспензійній культурі (що є можливим, наприклад, для CEF-клітин), в цьому випадку бажано використовувати фактори, вибрані з групи факторів росту. Прикладами факторів росту, придатних для цього типу культивування є рекомбінантні коров'ячий, мишачий, курячий та людський епідермальні фактори росту (EGF). Найбільш бажаним є рекомбінантний EGF людини (rh-EGF) (Chemicon Int., Cataloge number: GF001). Для клітин, котрі звичайно ростуть в суспензійній культурі, середовище може, переважно, містити фактор, вибраний з групи факторів росту, включаючи EGF. Найбільш переважними факторами росту для цього типу клітин є фактори, специфічні для неадгезивних клітин. Прикладами цих факторів росту є інтерлейкіни, GM-CSF, G-CSF та інші. Особа, досвідчена в даній галузі, може легко визначити звичайним експериментуванням, котрий з факторів придатний для цього типу клітин. Якщо доданий до безсироваткового середовища фактор є EGF, зокрема rh-EGF, бажано додавати його в концентрації від 1 до 50нг/мл, більш бажано від 5 до 20нг/мл. Однак, особа, досвідчена в даній галузі має мати на увазі те, що різні типи клітин можуть потребувати дещо різних концентрацій EGF в сироватці для оптимальних результатів. Якщо фактор адгезії доданий до безсироваткового середовища є фібронектином: (наприклад, Chemicon Int.; Фібронектин плазми людини, номер за каталогом FC010), то бажано його додавати до середовища в концентрації від 1 до 50, більш бажано від 1 до 10мкг/см 2 поверхні клітинної культуральної посудини. Однак, особа, досвідчена в даній галузі має мати на увазі те, що різні типи клітин можуть потребувати дещо різних концентрацій фібронектину в сироватці для оптимальних результатів. Згідно даного винаходу, є достатнім додавати лише один фактор вибраний з поміж факторів росту та факторів адгезії до середовища, зокрема, якщо клітини є адгезивними клітинами. Однак, є 10 також можливим додавати до середовища два або більше факторів, вибраних з поміж факторів росту та факторів адгезії. Середовище, переважно, може містити EGF та фібронектин, переважно в концентраціях наведених вище, зокрема якщо первинні клітини є адгезивними клітинами, такими як CEF-клітини. Середовище, також може містити один або більше компонентів, вибраних з мікробних екстрактів, рослинних екстрактів та з екстрактів тварин, що не є ссавцями. Мікробні екстракти є, переважно, дріжджовими екстрактами або yeastolateультрафільтратом. Рослинний екстракт, переважно, є рисовим екстрактом або екстрактом сої. Екстракт з нессавцевих тварин є, переважно, рибним екстрактом. Згідно переважної реалізації даного винаходу, до комерційного безсироваткового середовища, до якого додається фактор вибраний з поміж факторів росту та факторів адгезії, може додаватися аспарагін. Більш бажано, щоб аспарагін додавався до середовища, котре застосовується при інфікуванні вірусом (дивись нижче). Комерційні безсироваткові середовища звичайно містять аспарагін в концентраціях від 0,3 до 1,0мМ. Переважно аспарагін додається в кількості від 5,0 до 1,5мМ. Найбільш бажано додавати 1,0мМ аспарагіну. Загальна концентрація аспарагіну в середовищі, переважно, менше 2мМ, більш переважно в межах від 8,0 до 1,8мМ. Найбільш бажана концентрація аспарагіну в середовищі становить 1,3мМ. Крім того, бажано додавати до середовища глютамін. Більш бажано додавати глютамін до середовища, котре застосовується при інфікуванні вірусом (дивись нижче). Бажані кількості додавання глютаміну до середовища знаходяться в межах від 1 до 5мМ, більш бажано в межах від 2 до 4мМ. Вказані межі також відносяться до бажаних загальних концентрацій в середовищі, оскільки більшість комерційно доступних середовищ не містять глютаміну. Згідно наступної реалізації, винахід включає спосіб ампліфікації вірусу, що включає наступні етапи: на першому етапі первинні клітини культивуються згідно вище описаного способу, тобто, первинні клітини культивують в безсироватковому середовищі, яке містить фактор, вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії, залежно від типу клітин. Всі умови, визначення, переважні втілення й також порядок розташування переважних і найбільш переважних реалізацій подано вище для опису способу культивування первинних клітин, також застосовується для визначення першого етапу способу ампліфікації вірусу, згідно реалізації даного винаходу. На другому етапі первинні клітини інфікують вірусом. На третьому етапі інфіковані клітини було інкубовано в безсироватковому середовищі до одержання вірусного потомства. Термін "ампліфікація вірусу" використано для визначення того, що спосіб, згідно даного винаходу переважно використовувався для збільшення кількості вірусу, завдяки продуктивній вірусній реплікації вірусу в інфікованих клітинах. Іншими словами співвідношення між початковою кількістю 11 85543 вірусу й остаточною має бути вищим за 1. Отже, згідно даного винаходу, ці первинні клітини є підібраними для специфічного вірусу, в котрих вірус може продуктивно реплікуватися. Термін "репродуктивна реплікація" вказує на той факт, що специфічний вірус реплікується в специфічній первинній клітині, в такій мірі, щоб одержати інфекційне вірусне потомство, причому співвідношення між початковою кількістю вірусу й остаточною має бути вищим за 1. Особі досвідченій в даній галузі відомо, які віруси в яких типах клітин можуть бути репродуктивно репліковані. Як приклад первинних клітин можна привести фібробласти крайньої плоті людини, якщо вірус, що підлягає реплікації є цитомегаловірусом людини; первинні клітини можуть бути клітинами CEF, якщо вірус, що підлягає реплікації є вірусом кору, вірусом свинки, вірусом сказу, вірусом японського енцефаліту, вір усом жовтої лихоманки, вірусом грипу або поксвірусом таким, як вірус коров'ячої віспи, зокрема модифікований вірус коров'ячої віспи Ankara (MVA). Способи інфікування первинних клітин, згідно другого етап у даної реалізації є відомим особі досвідченій в даній галузі. Як приклад, можна вірус просто додати в середовище. Або середовище може бути видалене й вірус введено в свіже середовище, котре вводять клітинам на заміну. Для одержання ефективного інфікування кількість вірусно-середовищної суспензії має бути як найменша для одержання високої концентрації вірусу. Після приєднання вірусу можна додати іншу частину середовища. На третьому етапі клітини інокулюють в безсироваткове середовище, до одержання вірусного потомства. Безсироваткове середовище, яке використовується на другому та третьому етапах способу ампліфікації вірусу може бути тим самим середовищем яке застосовувалося до того, тобто, безсироваткове середовище, яке містить фактор вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії, залежно від типу клітин. Однак, для здешевлення можна використовувати на одному з, або обох, другому та третьому етапах, безсироваткове середовище, котре не містить фактор вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії. Підчас усіх етапів, до середовища можуть бути додані аспарагін та/або глютамін, як раніше було зазначено, причому загальна концентрація аспарагіну бажано така як зазначено вище. Вірусне потомство може бути концентровано й очищено згідно методів відомих особам досвідченим в цій галузі. Згідно переважній реалізації спосіб ампліфікації вірусів було використано для ампліфікації поксвірусів. Отже, згідно до переважної реалізації винахід відноситься до способів ампліфікації поксвірусів, який включає наступні етапи: (І) культивування первинних клітин згідно вище описаному способу, тобто, спосіб в якому первинні клітини культивуються в безсироватковому середовищі, яке містить фактор вибраний з групи, яка включає фактори росту та фактори адгезії, залежно віт типу 12 клітин, (II) інфікування первинних клітин поксвірусом та (III) культивування інфікованих клітин в безсироватковому середовищі до одержання вірусного потомства. Було неочікуваним, те, що поксвіруси можуть бути ампліфіковані в клітинах та за умов відсутності сироватки, оскільки клітини дуже погано росли на відомих безсироваткових середовищах. Отже, очікувалося, що додатковий стрес пов'язаний із поксвірусною інфекцією буде вбивати вже стресовані клітини до досягнення значної ампліфікації поксвірусу. Поксвірус, переважно є ортопоксвірусом. Прикладами ортопоксвірусів є пташині поксвіруси та віруси коров'ячої віспи. Термін "пташиний поксвірус" стосується будьякого пташиного поксвірусу, такого як пташиний поксвірус, канарейковий поксвірус, атиповий поксвірус, майна поксвірус, голубиний поксвірус, поксвірус папуги, павиний поксвірус, поксвірус пінгвіну, горобиний поксвірус, поксвірус шпака та поксвірус індика, переважними поксвірусами є канарейковий поксвірус та поксвірус дикої птиці. Прикладом канарейкового поксвірусу є штам Rentschler. Очищений методом бляшок штам канарейкового поксвірусу названого ALVAC (US 5,766,598), було депоновано згідно Будапештської угоди Американською колекцією типових культур (АТСС), під вхідним номером VR-2547. Інший штам канарейкового поксвірусу є . комерційним вакцинним штамом канарейкового поксвірусу позначений як LF2 СЕР 524 24 10 75, можна отримати в Institute Merieux, Inc. Прикладами пташиних поксвірусів є штами FP1, FP-5 та TROVAC (US 5,766, 598). FP-1 є штамом Duvette модифікованим для використання в якості вакцини одноденним курчатам. Цей штам є комерційним вакцинним штамом вірусу пташиної віспи означений як 0 DCEP 25/CEP67/2309 Жовтень 1980, який можна одержати в Institute Merieux, Inc. FP-5 є комерційним вакцинним штамом вірусу пташиної віспи, який походить з курячих ембріонів, і який можна одержати в American Scientific Laboratories (Division of Schering Corp.) Madison, Wisconsin, United States Veterinary Дозвіл No. 165, serial No. 30321. Прикладами штамів вірусу коров'ячої віспи є Temple of Heaven, Copenhagen, Paris, Budapest, Dairen, Gam, MRIVP, Per, Tashkent, TBK, Tom, Bern, Patwadangar, BIEM, B-15, Lister, EM-63, New York City Board of Health, Elstree, IKEDA та WR. Винахід бажано здійснювати на модифікованому штамі коров'ячої віспи Ankara (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12: 1032-40). Типовим штамом MVA є MVA 575 котрий депоновано в Європейській колекції тваринних клітинних культур під депозитарним номером ЕСАСС V00120707. Більш переважним штамом є MVA-BN та його похідні, котрі було описано в заявці РСТ/ЕР01/13628 поданій до Європейського патентного відомства в 22 листопада 2001, яка називалася "Modified Vaccinia Ankara Virus Variant". MVA-BN було депоновано Європейській колекції тваринних клітинних культур під депозитарним номером ЕСАСС V00083008. Характерні ознаки MVA-BN, опис біологічних тес 13 85543 тів, котрі дозволяють визначити чи є MVA саме MVA-BN або його похідним та методи котрі дозволяють одержувати MVA-BN або його похідні розкрито в вище зазначеній РСТ-заявці, яку повністю сюди включено шляхом посилання. Вірус ампліфікований, згідно способу даного винаходу може бути вірусом дикого типу, ослабленим вірусом або рекомбінантним вірусом. Термін "рекомбінтний вірус" відноситься до будь-якого вірусу, котрому у вір усний геном вставлений гетерологічний ген, котрий не є природною частиною вірусного геному. Гетерологічний ген може бути терапевтичним геном, геном для кодування пептиду, який включає, принаймні один епітоп для індукування імунну відповідь, антисмислову експресійну касету або рибо зимний ген. Способу конструювання рекомбінантним вірусів є відомими особі досвідченій в даній галузі. Найбільш переважним поксвірусним вектором є MVA, зокрема MVA 575 та MVA-BN (дивись ви ще). "Ослаблений вірус" є вірусом, котрий походить від патогенного вірусу, але при інфікуванні організму носія призводить до меншої смертності та/або захворюваності, порівняно із неослабленим батьківським вірусом. Приклади ослаблених вірусів відомі особі досвідченій в даній галузі. Прикладом ослабленого вірусу коров'ячої віспи Vaccinia є штам MVA, зокрема штам котрий депоновано в ЕСАСС із депозитарним номером V00083008 (дивись вище). Як зазначено вище, для поксвірусів первинними клітинами, переважно, можуть бути пташині клітини, такі як CEF-клітини або качині первинні ембріональні фібробласти. Також, особі досвідченій в даній галузі має бути відомо, які первинні клітини є придатними для ампліфікації в певних поксвірусах. CEF-клітинам надається перевага для ампліфікування MVA. Для ампліфікації MVA в CEF-клітинах переважною реалізацією є відбір одного або двох факторів обраних поміж EGF та фібронектином. Якщо спосіб згідно даного винаходу використовується для ампліфікації MVA в CEF-клітинах, бажано щоб початкове рН середовища було в межах від приблизно 7.0 до приблизно 8.5. зокрема бажано, щоб початкове рН було 7.0. Також винахід відноситься до вірусів, зокрема поксвірусів, одержаних методом описаним вище. Згідно переважного втілення винаходу поксвірус є вірусом коров'ячої віспи, найбільш бажано штамом MVA таким як MVA-BN. Винахід також включає композицію яка містить вірус, зокрема поксвірус, одержаний способом відповідно до даного винаходу. Як зазначено вище, поксвірус, переважно, є вірусом коров'ячої віспи, найбільш бажано штамом MVA таким як MVA-BN. Завдяки методу ампліфікації вірусу, одержана композиція не містить будь-яких продуктів та/або інфекційних чинників які містяться в тваринній плазмі. На відміну від цього композиції, які містять віруси, одержані звичайними способами містять залишкові речовини які походять з плазми. Це особливо важливо для випадку композицій, які містять поксвіруси, такі як, штами вірусу коров'ячої віспи. 14 Винахід також стосується вірусу, зокрема вірусів, як визначено вище, як медикамент або вакцина. Якщо вірус є вірусом дикого типу, вірус може бути використаний для вакцинації проти вірусу як такого. Для цих цілей зокрема бажано використовувати ослаблені віруси. Якщо вірус є рекомбінантним вірусом, котрий. експресує протеїни експресовані з генів гетерологічних вірусному геному, то є можливим вакцинувати проти вірусу як такого та/або проти експресованого гетерологічного протеїну. Якщо рекомбінантним вірус експресує терапевтичний ген, такий як антисмислова РНК або рибозим, то вірус може застосовуватися як медикамент. Винахід, також, стосується використання вірусу, як зазначено вище або композиція, як зазначено вище для виробництва вакцини. Винахід, також, відноситься до способу лікування або вакцинації тварин, включаючи людину, за їхньої потреби, який полягає у введенні вірусу зазначено вище або композиції як зазначено вище, в тіло тварини або людини. Приклади Якщо не зазначено інакше, в наступних прикладах без сироваткове середовище є середовищем 199 (Life Technologies). EGF, котрий додано, зазвичай є рекомбінантним EGF людини, одержаним від Chemicon. Фібронектин (FN) було одержано від Chemicon. Приклад 1: Приготування курячих ембріональних фібробластів (CEF-клітин) Вільні від специфічних патогенів (SPF) запліднені яйця зберігали на протязі не більше 12 днів при температурі 4°С. Яйця було поміщено в інкубатор й інкубовано на протязі 10-12 днів при 37.8°С±8°С. Було заготовлено чашки Петрі із 1020мл PBS, з розрахунку максимум на 11 яєць. Яйця було покладено в спеціальну яєчну коробку й інтенсивно оброблено Бацилолом для стерилізації зовнішньої оболонки яєчної шкарлупи. Після сушіння було зроблено отвір й обережно видалено яєчну оболонку. Відокремлено хоріоалантоїсну мембрану. Ембріони було піднято за ніжки й було відокремлено голови. Потім ембріони було перенесено на заготовлені чашки Петрі. Після відокремлення ніг експлантати було промито PBS. В 20мл шприц було поміщено максимум по 11 експлантатів й прочавлено на Ерленмайеровську колбу. Було додано по 5мл підігрітого (37°С) розчину трипсин/EDTA на кожний експлантат й розчин було збовтано на протязі 15 хвилин із без сироватковим середовищем за кімнатної температури в магнітній мішалці. Трипсинізовані клітини було злито через шар сита в мензурку. Усі клітини було перенесено в одну 225мл центрифужну пробірку й відцентрифуговано при 20°С, 470Хg на протязі 7 хвилин в настільній центрифузі. Після видалення супернатанту, осад було ресуспендовано в 1мл свіжої підігрітої (37°С) безсироваткового ростового середовища, яке містило 10нг/мл EGF на експлантат інтенсивним втягуванням й випорскуванням піпеткою. Свіже підігріте (37°С) безсироваткове ростове середовище, яке містило 10нг/мл EGF було додано до загального об'єму 150мл. Було повторено етап центрифугування. Було видалено суперната 15 85543 нту й осад було ресуспендовано як показано вище. Свіже підігріте (37°С) безсироваткове ростове середовище, яке містило 10нг/мл EGF було додано до загального об'єму 100мл. Клітини було підраховано, як показаного в наступному розділі. Необхідна кількість клітин була висіяна в ролерфлакони із безсироватковим ростовим середовищем, яке містило 10нг/мл EGF й інкубовано при (37°С). Клітини були готові до вірусного інфікування на четвертий день після висівання. Приклад 2: Підрахунок щільності клітин Зразок клітинної суспензії (дивись розділ приготування CEF) було взято й розмішано з одним об'ємом трипанового синього, що дало в результаті щільність клітин від 20 до 100 клітин на 16 маленьких квадратів гемоцитометра який поставляється Fuchs-Rosenthal під назвою Hemocytometer Fast Read 102 (1:2-1:10 розведення). Зразок було взято одразу після ресуспендування клітин для попередження реагрегацію/седиментацію клітин. Через декілька хвилин інкубування із трипановим синім щоб дати фарбнику достатньо пофарбувати мертві клітини, 10мкл клітинної суспензії було поміщено в гемоцитометр. Лише білі, живі клітини підраховувалися під світловим мікроскопом за допомогою об'єктиву 10х. Загалом, 3 репрезентативні великі квадрати, які являють собою 3X16 маленьких було підраховано. В кожному великому квадраті було підраховано лише дві суміжні сторони. Було взято середнє підрахованих клітин й вирахувана остаточна концентрація клітин за допомогою наступної формули: Середня кількість клітин x розведення x 104 = клітин/мл. Потім клітинна суспензія було доведена до потрібної робочої концентрації. Приклад 3: Ефект додавання фактору вибраного з поміж, факторів росту та факторів приєднання та фібронектину до безсироваткового середовища на формування CEF-моношару В попередніх експериментах винахідниками було показано, що CEF-клітини не приєднуються до поверхні клітинно-культуральних судин, якщо використовується середовище 199, котре не містить FCS. Більш того, моношар не утворюється. Нормальне утворення моношару спостерігалося якщо використовувалося середовище 199 із 7% FCS. Було проаналізовано чи відбудуться адгезія та ріст CEF-клітин в безсироватковому середовищі 199 якщо додати додаткові компоненти до середовища. Перевірені компоненти включали рекомбінантний епідермальний фактор росту (r-hEGF) та фібронектин (FN). Для експериментів СЕF-клітини вирощувалися на середовищі 199 із різними поодиничними або скомбінованими добавками. Клітини вирощені в середовищі 199 без будь-яких добавок виступали негативним контролем. Клітини, культивовані в середовищі 199 яке містило 7% FCS виступали позитивним контролем. Усі експерименти були проведені в 6-лункових клітинно-культуральних планшетах із 3мл середовища. Добавки було оброблено згідно довідкових матеріалів наданих виробником перед використанням в клітинній культурі. Фібронектину перед використанням було 16 дано 25 хвилин для адсорбування до поверхні клітинно-культуральних планшетів. Фібронектину застосовувався в концентрації 3мкг/см 2 й EGF використовувався в концентрації 10нг/мл. Перед додаванням клітин клітинно-культуральні планшети контактували із фібронектин-вмісним середовищем на протязі 25 хвилин. Кожне культуральне середовище із добавками, котре мало тестуватися, к ультивувалося із дублікатом. 6-лункові клітинно-культуральні планшети було інкубовано на протязі 4 днів при 37°С. З дня 1 по 4 адгезія й ріст клітин було оцінювано за допомогою мікроскопу. Для позитивного контролю спостерігалися нормальна адгезія й ріст CEF-клітин. Для середовища 199 без добавок майже зовсім не спостерігалося адгезії CEF-клітин. Радикальне покращення утворення моношару спостерігалося використанням EGF, доданого до середовища 199 порівняно із середовищем 199 без добавок. Було відмічено, що клітини адгезували й утворили характерну фібробластну морфологію. Також, постійний ріст можна було спостерігати у період до 4 днів. Поліпшення клітинної адгезії також досягалося додаванням фібронектину в культуральне середовище. Додавання й EGF, й фібронектину призводило до дещо кращого поліпшення порівняно із додаванням лише EGF або лише фібронектину. Підсумовуючи можна сказати, що утворення моношару CEF-клітин у безсироватковому середовищі 199 може бути підтримано використанням добавок EGF та фібронектину. Більш того, в паралельній серії експериментів 1x107 CEF-клітин було висіяно в середовище, котре містило 10% FCS, середовище, котре на містило FCS та середовище, котре не містило FCS та не містило EGF. Кількість клітин було підраховано через 2 дні після висівання. Кількість клітин становила до 42%, 6% та 44%, відповідно, від кількості клітин, що було висіяно. Отже, результати для клітин висіяних у безсироваткове середовище, котре містило EGS були такі ж добрі, як і результати одержані із середовищем, котре містило FCS та значно кращі за середовище котре не містило а ні сироватки, а ні EGF. Також, середовище, котре містило EGF було порівняно із різноманітними стандартними безсироватковими середовищами, такими як DMEM, Opti-Mem або 293-SFM. Для цього 1x107 CEFклітин було висіяно на різноманітні безсироваткові середовища й культивовано на протязі 4 днів. Кількість клітин культивованих в середовищі, котре містило EGF була у 24, 5 та 12 разів вищою за кількість клітин культивованих в безсироваткових DMEM, Opti.Mem та 293-SFM, відповідно. Приклад 4: Інфікування CEF-клітин MVA CEF-клітини були інфіковані на протязі чотирьох днів після висівання у ролер-флакони. На цей момент клітини виросли у відповідний моношар. Клітини були інфіковані із МОl 1 або 0.1 MVA. Для інфікування ростове середовище видаляли з колб. Потрібну кількість вірусу, на кожний ролер-флакон, розводили в 20мл відповідного інфекційного середовища без сироватки. На цьому етапі безсирова 17 85543 ткове середовище може містити, а може й не містити фактори обрані з поміж факторів росту та фібронектину. Клітини були інкубовані із вірусом на протязі при 37°С при 0.3-0.5об/хв. В ролерфлаконовому інкубаторі. Через 1 годину ролерфлакони були заповнені відповідним безсироватковим ростовим середовищем до загального об'єму 200мл у кожному ролер-флаконі. На цьому етапі безсироваткове середовище може містити, а може й не містити фактори обрані з поміж факторів росту та фібронектину. Вірусна реплікація була припинена після 48 або 72 годин заморожуванням ролер-флаконів до -20°С. Приклад 5: Приготування вірусних екстрактів з інфікованих CEF-клітин й титрування MVA Заморожені ролер-флакони були розморожені при кімнатній температурі. Підчас процесу розморожування клітини від'єднувалися від поверхні ролер-флакону й могли легко бути видалені шляхом збовтування флакону. Вірусно-клітинна суспензія була зібрана й розділена на менші об'єми. Для вивільнення вірусу з інфікованих клітин вірусно-клітинну суспензію було 3 рази заморожено й розморожено. Вірусні зразки одержані заморожуванням-розморожуванням були використані для титрування. Титрування було проведене на 1-му пасажі CEF-клітин і 96-лункових планшетах з використанням 10-кратного розведення вірусної суспензії та 8 реплікацій на розведення. Після інфікування, інфіковані клітини були візуалізовані за допомогою антитіл до вірусу коров'ячої віспи та відповідного фарбуючого розчину. Більш детально, в нульовий день аналізу первинні CEF-клітини (дивись розділ "Приготування курячих ембріональних фібробластів (CEFклітин)") були трипсиновані й підраховані як описано в розділі "підраховування щільності клітин". Клітини були розведені до 1x105 клітин/мл в середовищі RPMI із 7% FCS. Після цього розведення 100мкл було висіяно в кожну лунку 96-лункових планшетів, за допомогою багатоканальної піпетки. Клітини були інкубовані на протязі ночі при 37°С та 5% СО2. Вірусні зразки, призначені для титрування (дивись розділ "Приготування вірусних екстрактів з інфікованих CEF-клітин") були послідовно розведені 10-кратними етапами від 10-1-10-12 за допомогою RPMI без сироватки. Це послідовне розведення виконувалося додаванням 900мкл RPMI в лунки 96-глибоко-лункових планшетів. По 100мкл вірусного зразка було внесено в кожну лунку першого ряду й розмішано. Потім, по 100мкл кожного зразка було перенесено в наступний ряд лунок за допомогою багатоканальної піпетки. 96глибоко-лункові планшети тримали на льоду під час проведення розведень. Планшети інкубували на протязі 5 днів при 37°С та 5% СО2 щоб дати відбутися інфікуванню. Після 5 днів, клітини були імуногістохімічно пофарблені за допомогою антитіл специфічних до вірусу коров'ячої віспи. Для пофарблення культуральну рідину видаляли перевертанням до гори дном над резервуаром. Клітини були зафіксовані введенням 100мкл/лунку суміші метанол/ацетон (1:1) на протязі 10 хвилин за кімнатної температури. Фіксуючий розчин вида 18 ляли й лунки сушили повітрям. Після сушіння клітини було промито PBS й інкубовано на протязі 1 години при кімнатній температурі із антитілами до вірусу коров'ячої віспи (антитіла до вірусу коров'ячої віспи, кролячі поліклональні, фракція IgG (Quartett, Berlin, Germany #9503-2057) розведеними до 1:1000 в PBS із 3% FCS. Після видалення антитіл, клітини були промиті двічі у PBS й інкубовані на протязі 1 години при кімнатній температурі із анти-кролячими антитілами (анти-кролячі IGG антитіла, зв'язані із HRP козлячі поліклональні (Promega, Mannheim, GERMANY # W4011) зв'язаними із HRP (Horse Radish Peroxidase) розведеними до 1:1000 в PBS із 3% FCS. Знову, клітини були промиті PBS й пофарблені або о-діанізидином або ТМВ. Для застосування методики пофарблення одіанізидином, клітини були інкубовані із 100мкл/лунку фарбую чого розчину, котрий містив 5мг о-діанізидину та 180мкл 30% Н2O2 на 60мл 50мМ фосфа тно-цитратного буфер у. Клітини були інкубовані при кімнатній температурі, доки вони не пофарбувалися в коричневий. Інфіковані клітини було чітко видно після 1-3 годин. При застосування методики пофарблення ТМВ, клітини інкубували із 30мкл/лунку 1,2мМ ТМВ (Seramun Diagnostica GmbH). Через 15 хвилин інкубування, розчин ТМВ було видалено й клітини одноразово були промиті PBS. Інфіковані клітини були темно-синіми. Планшети було обраховано на інфіковані клітини. Вірусний титр було обчислено за формулою Spearman & Kaerber. Для обчислення ТСID50 усі лунки із коричневими або синіми клітинами були марковані як позитивні. Оскільки параметри досліду залишалися постійними, було використано наступну спрощену формулу: Вірусний титр [TCID50/мл] = 10[a+1.5+ xa/8+ xb/8+xc /8] а = фактор розведення в останній колонці, в котрій усі вісім лунок позитивні xа = кількість позитивних лунок в колонці а+1 хb = кількість позитивних лунок в колонці а+2 xс = кількість позитивних лунок в колонці а+3 Приклад 6: Оптимальна щільність посіву CEFклітин в безсироваткове середовище й оптимальна кількість MVA для інфікування CEF-клітин Оптимальна щільність висівання клітин 7.5x107 клітин/850см 2 (поверхня ролер-флакону) була визначена для безсироваткового вирощування CEF. Клітини були здатні на четвертий день після висівання побудувати гарний моношар без утворення великих згустків й могли бути інфіковані в цей момент часу. Були проведені експерименти для визначення найкращого рівня вірусної інокуляції та тривалості інфікування для максимального отримання MVA з CEF-клітин, культивованих у безсироватковий спосіб. CEF-клітини були висіяні із щільністю 7.5x10 7 клітин/850см 2 в середовище згідно даного винаходу. На 4-й день після висівання, клітини були інфіковані різними кількостями MVA в межах від 0.05 до 1.0 ТСID50/клітин MVA. Найкращі результати були отримані при значенні 0.1 ТСID50/клітин MVA. Приклад 7: Оптимальне рН безсироваткового середовища для культивування й інфікування MVA MVA та інші поксвірусні інфекції є чутливими до рН нижче 7.0. Поксвіруси не стабільні при кис 19 85543 лотному рН, і тому рекомендується зберігати очищені поксвіруси в забуференому розчині при рН нижче 7.0 для забезпечення стабільності й цілісності при зберіганні як рідкого вірусного продукту. Були проведені експерименти для визначення для визначення впливу на ви хід вірусу при проведенні інфікування при різних початкових рН. Ролерфлакони були засіяні CEF-клітинами у звичайний спосіб у безсироваткове середовище, котре містить 10нг/мл EGF та 4мМ L-глютаміну й культивували на протязі 4 днів. Клітини було інфіковано 20 MVA із 0.1 ТСID50/клітин в безсироватковому середовищі, котре містило 10нг/мл EGF та 4мМ Lглютаміну та 1мМ аспарагіну при різних значеннях рН від 6.5 до 9.0. На 72 годину після інфікування, рН було визначено середовища й вихід. вірусу був визначений титруванням клітинних екстрактів звичайним способом. Результати представлено в наступній таблиці, котра показує вплив початкового значення рН середовища на початку інфікування на вихід вірусу. Безсироваткове середовище із 10нг/мл EGF Початкове рН 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 рН на 72г. п.і. 7.05 7.34 7.53 7.68 7.75 8.03 Для інфікувань, проведених на безсироватковому середовищі, яке містить 10нг/мл EGF із додаванням L-глютаміну та аспарагіну, продукування вірусу було відносно постійним при початковому рН від 7.0 до 8.5 але продукування вірусу було низьким при початковому рН 6.5 та 9.0. Найкращий результат було отримано при початковому 7.0. Комерційні безсироваткові середовища звичайно мають 7.4. Тим не менш доведення рН безсироваткового середовища до 7.0 може допомогти покращити вихід вір усу. Приклад 8: Ефект від додавання аспарагіну в безсироваткове поживне середовище Попередні експерименти показали, що кількість аспарагіну під час культивування CEF-клітин та інфікування CEF-клітин MVA може зменшува тися. Для запобігання виснаження безсироваткового середовища на аспарагін під час культивування й інфікування, додатково вводять аспарагін в середовище як добавку перед інфікуванням CEFклітин. Для визначення оптимальної кількості аспарагіну, яка необхідно ввести в середовище, ролер-флакони були засіяні CEF-клітинами (7.5x10 7 клітин/850см 2) в безсироваткове середовище, яке включало 10нг/мл EGF та 4мМ L-глютаміну. Чотирма днями пізніше висівання клітини були інфіко Комп’ютерна в ерстка А. Крулевський Титр [ТСID50/мл] 0.56x107 10.0x107 5.60x107 8.60x107 7.80x107 0.65x107 вані MVA із 0.1 ТСID50 /кл у безсироваткове середовище, котре включало 10нг/мл EGF та 4мМ Lглютаміну доповнене різними концентраціями аспарагіну (0.5, 1.0 та 1.5мМ). Вірусна реплікація була припинена на 72 годину після інфікування й визначено вірусні титри. Результати приведено в наступній таблиці, котра показує одержання MVA з CEF-клітин при додаванні різних кількостей аспарагіну на стадії інфікування. Титри представляють середнє значення 3 ролер-флаконів стосовно додавання аспарагіну. Додано аспарагіну 0.0 mM 0.5 mМ 1.0 mМ 1.5 mМ Вірусні титри після 72 годин [ТСID50 /мл] 1.8x108 1.3x108 6.8x108 1.0x108 Результати демонструють, що доповнення безсироваткового середовища 10нг/мл EGF із аспарагіном може покращити продукування вірусу й доповнення 1мМ для інфекційного процесу є оптимальним. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601