Спосіб оцінки функціонального стану лейкоцитів

Спосіб оцінки функціонального стану лейкоцитів, що включає нанесення клггин крові на предметне скло, інкубування у вологій камері, відмивання препаратів у забуференому ізотонічному розчині, фіксацію спиртом, послідовне нанесення на препарат лектину, який специфічно зв'язується з поверхневими глікопротеїдами лейкоцитів, маркера лектину - пероксидазу хріну, інкубування з діамінобензидіном та визначення продуктів окиснення полімерізацм, який відрізняється тим, що додатково в кров додають фізіологічно активну речовину, як лектин використовують конканавалін-А, забарвлюють ядра лейкоцитів 1 % розчином сафраніну, а оцінку функціонального стану лейкоцитів проводять по продуктах окиснення полімерізацм з використанням середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнта Запропонований спосіб відноситься до галузей біологи і медицини та може бути використаний для оцінки реакції лейкоцитів на різні екзогенні та ендогенні впливи в дослідах ВІДОМІ способи оцінки функціональної активності лейкоцитів [Лебедев К И , Понякина И Д Иммунограмма в клинической практике - М Наука, 1990 - С 91 - 101, Нагоев Б С Модификация цитохимического метода восстановления нитросинего тетразолия//Лабораторное дело - 1 9 8 3 - № 8 - С 7 - 1 1 , Пигаревский В Е Зернистые лейкоциты и их свойства - М Медицина, 1978 - 128 с , Лимфоциты Методы Ханс С / Под ред Клауса Дж, Пер с анг - М , "Медицина", 1990 - 395 с , Чернушенко Е Ф , Когосова Л С Иммунологические исследования в клинике - Киев "Здоров'я", 1978 - С 1 3 - 1 5 ] Найбільш близьким до запропонованого способу є спосіб оцінки функціонального стану клітин тканини, що включає нанесення клггинної суспензії на предметне скло, інкубування у вологій камері протягом 2 годин, фіксацію метиловим спиртом та їх репдратацію, нанесення на ЗО - 60 хвилин специфічного до вуглеводного залишку глікопротеїдів клггин лектину, відмивання в забуференому ізотонічному розчині, інкубування препаратів з пероксидазою хріну або тиреоглобуліном, які вибірково зв'язують лектин, виявлення пероксидази хріну (або тиреоглобуліна), для чого препарати інкубують з одним із хромогенів (3'3-діамінобензидін, тетраметілбензидін, пара-фенілдіамш-пірокатехол, 4-хлор-1-нафтол) Активність пероксидази хріну (або тиреоглобуліну) та ВІДПОВІДНО локалізацію по в'язаного з глікокон'югатом лектину визначають по коричневим відкладенням продуктів окиснення полімерізацм [Луцик А Д , Детюк Е С, Луцик М Д Лектины в гистохимии - Львов Львовский университет, 1989 - 1 4 4 с] Недоліком відомого способу є його трудоємність, неможливість вивчення зміни поверхневих глікопротеїдів клггин після їх функціонального навантаження та диференціювання клггин у КЛІТИННІЙ суспензії В основу винаходу поставлена задача створити спосіб оцінки функціонального стану лейкоцитів шляхом удосконалення відомого способу, дослідити зміни поверхневих глікопротеїдів після їх функціонального навантаження, забезпечити можливість диференціювання клггин у КЛІТИННІЙ суспензії та досягти спрощення виконання способу Поставлену задачу вирішують створенням способу оцінки функціонального стану лейкоцитів, що включає нанесення крові на предметне скло, інкубування крові у вологій камері, відмивання препаратів у забуференому ізотонічному розчині, фіксацію спиртом, нанесення на препарат лектину конканаваліну-А, який специфічно зв'язується з моновуглеводним залишком поверхневих глікопротеїдів клггин D-манозою та маркеру лектина - пероксидазу хріну, інкубування з діамінобензидіном, визначення продуктів окиснення полімерізацм, в якому, згідно з винаходом, додатково в кров дода ю ють фізіологічно активну речовину, проводять забарвлення ядер лейкоцитів 1% розчином сафраніну, а оцінку функціонального стану лейкоцитів проводять по продуктах окиснення полімерізацм з використанням середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту Запропонований нами спосіб дає можливість дати оцінку функціонального стану лейкоцитів шляхом підрахунку зміни поверхневих глікопротеїдів з моновуглеводним залишком D-манозою, які відіграють роль у реалізації головних функцій лейкоцитів - ВІДПОВІДІ на антиген, активації комплемента, опсонізацм мікроорганізмів та в посиленні процессів фагоцитозу [СеІІа М , Lanzavecchia A Antigen Targeting to DCs Via the Mannose-receptor - Basel , 1995 - P 97, Дранник ГН Клиническая иммунология и аллергология Одесса "Астро Принт", 1999 604 с ] та одночасне диференціювання лейкоцитів Спосіб достатньо простий, не потребує великих фінансів та часу Спрощення методу досягають виключенням з процесу дегідратації препаратів, заміну фіксатора препаратів на етиловий спирт, який не дає високої токсичної дії, дешевший та доступний для використання (метиловий спирт є токсичним та дефіцитним), а можливість диференціювання клггин крові досягають за рахунок додаткового забарвлення клггин крові розповсюдженням та простим у використанні барвником - сафраніном Заявлений спосіб здійсняють наступним чином Використовують кров донорів у КІЛЬКОСТІ 0,5мл Кров шкубують з дослідною фізіологічно активною речовиною протягом двох годин на предметних стеклах у вологій камері Прикріплені до скла лейкоцити відмивають від еритроцитів в забуференому ізотонічному розчині (рН 7,4), фіксують етиловим спиртом 5 хвилин та шкубують протягом ЗО хвилин з пектином конканаваліном-А (30мкг/мл), який має вуглеводну специфічність до поверхневих глікопротеїдів з моновуглеводним залишком D-манозою В якості маркеру конканаваліну-А використовує пероксидазу хріну (30мкг/мл), яку наносять на препарати на ЗО хвилин Активність пероксидази та ВІДПОВІДНО локалізацію пов'язаного з глікокон'югатами конканаваліну-А виявляють у розчині, який вміщує 0,05% 3,3-діамшобензидіну тетрапдрохлориду та 0,015% перекису водню у забуференому ізотонічному розчині Ядра лейкоцитів фарбують ЗО секунд у 1% розчині сафраніну Стан поверхневих глікопротеїдів з моновуглеводним за 45149 лишком D-манозою лейкоцитів оцінюють під мікроскопом по коричневих відкладеннях продуктів окисної полімеризації діамінобензидину у вигляді гранул за допомогою середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту для кожного виду клггин окремо Для кількісної оцінки зміни манозомісних мембранних структур лейкоцитів усі клггини ділять на групи До першої нульової групи відносять клггини без забарвлення, до 2-і групи - клггини, площа забарвлення яких була до 25% , до 3-і групи - площа забарвлення клггин 25 - 75%, до 4-і групи - клітини, які повністю забарвлені Для визначення показника середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту на препаратах враховують 100 клггин Отримане число множать на номер групи і суму отриманих добутків ділять на 100 Це число являє собою показник середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту ступеню експреси манозомісних мембранних структур лейкоцитів Показник середнього ЦИТОХІМІЧНОГО коефіцієнту = (1 а + 2в + Зс + 4d)/100, де (а, в, с, d - КІЛЬКІСТЬ клггин ВІДПОВІДНО нульової, 1, 2, 3 і 4 групи) [Нагоев Б С Модификация цитохимического метода восстановления нитросинего тетразолия //Лабораторное дело -1983 - № 8 - С 7 - 1 1 ] Приклади Щоб довести ефективність методу оцінки функціонального стану лейкоцитів на основі дослідження експресії манозомісних мембранних структур лейкоцитів, нами було одночасно проведено серію ДОСЛІДІВ на крові донорів для встановлення кореляційної залежності, яку досліджували між експресією манозомісних мембранних структур лімфоцитів та нетрофілів, а також показниками функціональної активності нейтрофілів тест з використанням нггросинього тетразолію, показниками фагоцитозу, лізосомальними катіонними білками [Посібник з експериментально-клінічних досліджень в фармакологи, біологи та медицині / Беркало Л В , Бобович О В , Боброва НО та ін , під ред Кайдашева І П , Соколенко В М, Катрушова О В Полтава, вид-во УМСА, 1996 - 271 с ] та мембранними маркерами лімфоцитів Т-лімфоцитів CD3 та В-лімфоцитів CD22 [Сидоренко С П Поверхностные антигены клеток человека, систематизированные международными рабочими совещаниями по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека // Імунологія та алергологія 1998 - № 3 - С 1 6 - 3 8 , Лимфоциты Методы Ханс С /Под ред Клауса Дж , Пер с анг - М "Медицина", 1990 - 3 9 5 с ] ( т а б л 1) Таблиця 1 Коефіцієнти попарної кореляції між експресією манозомісних мембранних структур лімфоцитів та нейтрофілів і показниками клггинного імунітету на крові донорів (п = 40) Тест з Манозомісні Манозомісні Пізосомальн Маркери Т- Маркери Ввикористанням мембранні мембранні Фагоцитоз катіонні лімфоцитів лімфоцитів нітросинього структури структури білки CD3 CD22 тетразолію лімфоцитів нейтрофілів Тест з викори- г станням нгг- Р росинього тегразолію Фагоцитоз г -0,224 0,104 р 45149 Продовження таблиці 1 Пізосомальні катіонні білки Манозомісні мембранні структури пімфоциті Манозомісні мембранні структури нейтрофілів Маркери Тпімфоцитів CD3 Маркери Впімфоцитів CD22 г Р г р -0,124 0,208 -0,152 0,096 -0,121 0,324 +0,780 0,001 * г р -0,081 0,034 0,795 0,0024 * -0,084 0,386 +0,077 0,163 г р -0,187 0,069 +0,740 0,034 * -0,354 0,078 +0,694 0,084 * -0,249 0,124 г р -0,131 0,204 +0,428 0,0081 * +0,422 0,0039 * -0,110 0,352 +0,406 0,0033 * +0,489 0,0032 * Примітка * - вірогідні коефіцієнти кореляції, г коефіцієнти кореляції, р - показник надійності коефіцієнту кореляції Виявлено, що експресія манозомісних мембранних структур лімфоцитів була пов'язана кореляціями середньої сили з експресією CD3 Тлімфоцитів (г = 0,694) і ЛКБ гранулоцитів (г = 0,489) нейтрофілів Вона також утворювала позитивну кореляцію з показником фагоцитозу (г = 0,780) В цих же зразках крові експресія манозомісних мембранних структур нейтрофілів формувала вірогідну позитивну кореляцію з маркером В-лімфоцитів CD22 (г = 0,406), з показником фагоцитозу (г = 0,795) та ЛКБ (г = 0,422) Також був виявлений кореляційний зв'язок між показниками фагоцитозу та маркером Тлімфоцитів CD3 (г=0,740) Таким чином, виявлено, що експресія манозомісних мембранних структур лімфоцитів та нейтрофілів пов'язана з показниками їх функціональної активності, дослідження яких може бути використано для оцінки функціонального стану одночасно як лімфоцитів так і нейтрофілів Нами також були проведені на крові донорів досліди впливу неселективного стимулятора а-, -0,104 0,125 р-адренорецепторів адреналіну [Машковский М Д Лекарственные средства В 2т /Харьков Торсинг, 1997 - Т 1 - 560 с ] на експресію поверхневих манозомісних мембранних структур лімфоцитів та нейтрофілів Адреналін використовували у трьох концентраціях 220хЮ"12/мл, 440хЮ"12/мл, 660x10" 12 /мл Функціональну активність лімфоцитів та нейтрофілів оцінювали за допомогою визначення експресії манозомісних мембранних структур запропонованим способом Наші дослідження показали, що адреналін у концентраціях 220х10"12/мл і 440х10"12/мл викликав вірогідне зниження експресії манозомісних мембранних структур лімфоцитів у порівнянні з контрольними серіями У той же час концентрація 660x10~12/мл спричинила незначну інгібуючу дію Дослідження ВІДПОВІДІ нейтрофілів під дією адреналіну виявило, що а-, р-адреностимуляція не викликала змін експресії манозомісних мембранних структур у концентрації 220х10~12/мл У концентрації 440x10~12/мл ми спостерігали незначне посилення експресії манозомісних мембранних структур, а у концентрації 660x10" 12 /мл - вірогідне посилення експресії манозомісних мембранних структур (табл 2) Таблиця 2 Вплив адреналіну на експресію манозомісних мембранних структур лімфоцитів та нейтрофілів (п = 6) Експресія 0,9% розчин Дози внесеного адреналіну манозомісних хлориду натрію мембранних структур Контроль 220x10"'7м л 440x10" '7м л 660x10" '7м л Лімфоцити 1,45±0,06 1,26±0,04* 1,39±0,23 1,07±0,05* Нейтрофіли 1,52±0,09 1,51±0,17 1,60±0,08 1,79±0 04* Примітка * - вірогідність ВІДМІН показників в порівнянні з контролем (р < 0,05) Таким чином, дія адреналіну на поверхневі структури лімфоцитів та нетрофілів призводить до зміни експресії їх манозомісних мембранних структур, що вказує на його вплив на функціональну активність лейкоцитів ДП "Український інститут промислової власності "(Укрпатент) Україна, 04119, Киів-119, вул сім'ї Хохлових, 15 (044) 456-20-90