Спосіб визначення концентрації рибоксину в сироватці крові шляхом капілярного електрофорезу

Спосіб визначення концентрації рибоксину в сироватці крові шляхом капілярного електрофорезу, який відрізняється тим, що відібрану пробу сироватки крові поляризують шляхом змішування з буферною сумішшю при співвідношенні масових частин 1 1, дегазують, змішують з дистильованою водою у співвідношенні 1 10 і використовують як форетичне середовище при міграції крізь капілярну трубку та електроліт в бік до анода, детектують оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби, отримують електрофореграму, по термінах виходу сигналів тривалістю 5,00-5,25 хвилин ідентифікують сигнали фракцій рибоксину на фоні сигналів присутніх домішок та визначають концентрацію шляхом співвідношення площ ПІКІВ фракцій рибоксину в пробі з каліброваними лічильними площинами стандартних концентрацій рибоксину, при цьому для виготовлення буферної суміші як електроліту використовують розчин борної кислоти, тетраборату натрію та води дистильованої у співвідношенні об'ємних частин 5,5 6,5 38,0 см 3 Винахід відноситься до досліджень або аналізу матеріалів шляхом розділення на складові частини та досліджень медичних препаратів і може бути використаним в медицині Рівень техніки, який досліджений заявником, інформує про відсутність об'єктів, що мають відношення до визначення вмісту рибоксину в сироватці крові На підставі відсутності співпадінь призначення відомих об'єктів, до важливішими характеристиками яких є середовище, що утримує фракції шуканого агенту (сироватка крові), функція (визначення концентрації) і конкретний вид матеріалу (рибоксин) можливо стверджувати про відсутність аналогів для винаходу, що заявляється У основу винаходу поставлена задача розробити спосіб визначення концентрації рибоксину в сироватці крові, який шляхом капілярного електрофорезу забезпечує технологічно сприйнятливу чутливість і ступінь екстракції шуканого агента при використанні Поставлена задача вирішується тим, що, згідно з винаходом, спосіб визначення концентрації рибоксину в сироватці крові шляхом капілярного електрофорезу характеризується тим, що відібра ну пробу сироватки крові поляризують шляхом змішування з буферною сумішшю при співвідношенні масових частин 1 1, дегазують, змішують з дистильованою водою у співвідношенні 1 10 і використовують як форе-тичне середовище при міграції крізь капілярну трубку та електроліт в бік до аноду, детектують оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби, отримують електрофореграму, по термінах виходу сигналів тривалістю 5,0 - 5,25 хвилин ідентифікують сигнали фракцій рибоксину на фоні сигналів присутніх домішок та визначають концентрацію шляхом співвідношення площ ПІКІВ фракцій рибоксину в пробі з каліброваними лічильними площинами стандартних концентрацій рибоксину, при цьому для виготовлення буферної суміші як електроліту використовують розчин борної кислоти, тетраборату натрію та води дистильованої у співвідношенні об'ємних частин 5,5 6,5 38,0 см 3 Для забезпечення означеного технічного результату буферна суміш, з одного боку, являє форетичне середовище, що є необхідним для відтворення капілярного електрофорезу, а з іншого є носієм всіх виділених фракцій Виділення останніх виконують на підставі поляризації проби, внаслідок чого шуканий агент стає нативним в ІОННІЙ фо ю 45914 рмі, а його нейтральні молекули посилюють звязки з зарядженими частками буфера Від того фракції рибоксину можуть переміщуватися під впливом електричного поля та бути впізнаними засобом детектування Дегазація зумовлює потрапляння проби в замалий перетин капіляру та безперешкодливе переміщення цього форетичного середовища в його порожнині Між тим, останні умови істотно впливають на термін виходу рибоксину, спотворення результатів ідентифікації та детектування, об'єктивність й швидкість визначення рибоксину та зумовлюють технологічно сприйнятливу чутливість і ступінь його екстракції При цьому співвідношення масових частин сироватки крові та буферної суміші в пробі, наприклад в пробірці Еппендорфа, найбільш доцільне в КІЛЬКОСТІ 1 1, оскільки при збільшенні КІЛЬКОСТІ буфера в пробі знижується чутливість детектора та спотворюються ВИХІДНІ дані, а при зменшенні погіршуються міграційні можливості виділених фракцій, фізичні властивості форетичного середовища та відбувається виснаження останнього Змішування проби з дистильованою водою у співвідношенні 1 10 виключає сукупність раптових помилок, що означені вище, і є найбільш оптимальним Так, при збільшеній концентрації проби, виникають переважно помилки ідентифікації рибоксину з-поза не досить стабільного виходу фракцій, перешкод у потраплянні цього робочого розчину в порожнину капіляру крізь замалий геометричний перетин при міграції до аноди, а при зменшеній концентрації погіршуються міграційні можливості виділених фракцій, фізичні властивості форетичного середовища, виснажується робоче середовище, які належать до чинників низького коефіцієнту корисної дії форетичного процесу Детектування оптичної ЩІЛЬНОСТІ дозволяє отримати електрофореграму поляризованих фракцій під час міграції до анода, виявити амплітуду ВІДПОВІДНИХ сигналів й терміни виходу вмісту проби Ідентифікація збігається до розпізнавання сигналів фракцій рибоксину по тривалості виділення на фоні сигналів інших домішок Експериментальне встановлено, що термін виходу стандартних концентрацій рибоксину в сироватці крові під впливом поляризації сягає 5,00 -5,25 хвилин і є істотною ознакою сигналів, що притаманні поляризованим фракціям рибоксину в сироватці крові, здатною відрізнити шуканий агент від безлічі присутніх домішок Використання експериментальних даних про стандартні концентрації рибоксину в сироватці крові, у вигляді площ ПІКІВ електрофореграми, як каліброваних лічильних одиниць, що насамперед є прямопропорційними до зареєстрованих амплітуд сигналів електрофореграми, найбільш доцільне в обчисленні концентрації екстрагованих часток рибоксину КІЛЬКІСТЬ об'ємних частин борної кислоти, тетраборату натрію та води дистильованої у буферному розчині, що надана дискретним співвідношенням 5,5 6,5 38,0 см 3 зумовлює необхідну полярність форетичного середовища, виключення систематичних і раптових помилок, спотворення результатів та вважається найбільш доцільною для отримання максимального технічного результату, що заявляється Тож, за наявністю причинно-наслідкових звязків з технічним результатом сукупність відокремлюючих ознак заявленого об'єкта є істотною ВІДОМОСТІ, ЩО підтверджують можливість здійснення способу визначення концентрації рибоксину в сироватці крові полягають в наступному Для визначення вмісту рибоксину в експериментальній пробі можливо застосування промислової системи капілярного електрофорезу «Капель-ЮЗР» (виробництва Росії), кварцового капіляру 0 0,075мм довжиною 600мм, ваг лабораторних 2 класу, мір маси, рН метру, дозаторів піпеточних змінних обсягів (5 - 50, 50 - 200 та 200 1000мм3), програмного забезпечення «Мультіхром» і комп'ютера мінімальної конфігурації Допускається використання приладів і устаткування інших моделей з аналогічними або більш кращими метрологічними характеристиками ДОПОМІЖНІ пристрої центрифуга, пробірки одноразові типу Еппендорфа, МІСТКІСТЮ 1,5СМ , фільтри целюлозно-ацетатні, з діаметром пір біля 20мкм, насадки фільтра Реактиви вода дистильована, борна кислота, натрій тетраборнокислий Спосіб визначення концентрації рибоксину в сироватці крові виконують у наступній ПОСЛІДОВНОСТІ ПІСЛЯ ПІДГОТОВКИ сироватки крові у пробірку Еппендорфа додають буферний розчин, витримуючи співвідношення масових частин 1 1 При цьому буфер містить борну кислоту, тетраборат натрію та воду дистильовану при співвідношенні об'ємних частин 5,5 6,5 38,0см3 Приготовлений розчин у подальшому використовують як електролітичне середовище, що розміщується між капіляром та джерелом електрорухомої сили Аналогічну суміш проби сироватки крові з тим же буфером при співвідношенні масових частин 1 1, після відповідної дегазації та змішування з дистильованою водою у співвідношенні 1 10, використовують як форетичне середовище у капілярному електрофорезі Вплив буфером на відібраний аналізат дозволяє поляризувати вміст і виділити фракції у іонному вигляді Під час електрофорезу поляризовані нейтральні молекули рибоксину мігрують від пробірки з пробою в бік до анодв крізь капілярний провідник та суміш сироватки крові з буфером, як електролітичне середовище, завдяки взаємодій із зарядженими молекулами форетичного середовища, та детектують оптичну ЩІЛЬНІСТЬ проби на довжині хвилі аналізатора 254 нм, який розміщують впритул до капіляру Отримують електрофореграму та ідентифікують на фоні сигналів присутніх домішок сигнали фракцій рибоксину по терміну виходу в межах 5,00 - 5,25 хвилин Шляхом зіставлення площ ПІКІВ електрофореграми з каліброваними лічильними площинами стандартних концентрацій рибоксину, що прямопропорційні до амплітуд сигналів останнього, визначають концентрацію рибоксину в сироватці крові Програмне забезпечення «Мультіхром» з комп'ютером забезпечують обчислення вихідних даних Тож, спосіб дозволив шляхом капілярного електрофорезу забезпечити технологічно сприйнятливі чутливість і ступінь екстракції шуканого агента з можливістю проведення адекватних терапевтичних втручань у подальшому Додаткові характеристики нового об'єкта ш 45914 формують про повноту визначення аналізата в кою, визначали оптичну ЩІЛЬНІСТЬ вмісту Сигнал з пробі, забезпечення високої швидкості визначення приладу надходив до комп'ютера та відбивався у його концентрації, обмеження використання токсивигляді електрофореграми, що характеризувалася чних засобів в дослідженнях, низьку вартість базонаявністю амплітудних спалахів присутніх домішок вого обладнання та допоміжних матеріалів, досягу вигляді ПІКІВ кривої, з прямопропорційною заленення технологічних зручностей та спрощень при жністю до їх концентрацій в аналізаті На фоні сигвідтворенні способу, високу об'єктивність визнаналів присутніх домішок сигнали фракцій рибоксичення вмісту, можливість визначення фракцій інну були ідентифіковані по терміну виходу в межах ших елементів водночас з визначенням вмісту 5,00 - 5,25 хвилин Шляхом зіставлення площ ПІКІВ рибоксину тощо електрофореграми з каліброваними лічильними площинами стандартних концентрацій рибоксину На прикладі конкретного використання концевизначали його концентрацію у відібраній сировантрацію рибоксину визначали наступним чином тці крові Програмне забезпечення «Мультіхром» з Для виготовлення буферного розчину, що викомп'ютером забезпечували обчислення та обробкористовували як електролітичне середовище, до 3 ку вихідних даних мірної колби МІСТКІСТЮ 50см додавали 5,5см роз3 чину борної кислоти при концентрації 0,2 моль/дм Загальна межа виявлення рибоксину (чутли3 6,5см розчину тетраборату натрію при концентвість) у пробі сироватки крові становила 30нг/мл, рації 0,05 моль/дм3 і доводили обсяг до мітки дисйого екстракція сягала 100%, час виходу - 5 хв, а тильованою водою термін аналізу -7 хв Для виготовлення буферного розчину, що виОтже, на прикладі конкретного використання користовували для поляризації сироватки крові, до об'єкта доведена можливість відтворення процесу, мірної колби МІСТКІСТЮ 50см аналогічним чином пов'язаного з визначенням концентрації рибоксину додавали 5,5см3 розчину борної кислоти при кону сироватці крові, який шляхом капілярного елект3 3 центрації 0,2 моль/дм , 6,5см розчину тетраборарофорезу забезпечив технологічно сприйнятливу ту натрію при концентрації 0,05 моль/дм3, а потім чутливість визначення та ступінь екстракції шукадистильованою водою обсяг доводили до мітки ного агента Використання об'єкту науководослідними лабораторіями медичних підприємств Поляризація 0,3см3 сироватки крові збігалася допоможе своєчасно корегувати вміст даного фадо вміщення в пробірку Еппендорфа 0,3см3 буфермакологічного засобу в крові рного розчину та перемішування Після поляризації й дегазації аналізату на центрифузі протягом 4 хвилин зі швидкістю 3200 Таблиця об/хв приготовляли робочій форетичний розчин з Техніко-економічні характеристики способу вираніш поляризованої проби шляхом десятикратнозначення концентрації рибоксину в сироватці крого зменшення II концентрації дистильованою вові шляхом капілярного електрофорезу дою Заявлене На ДІЛЯНЦІ між пробіркою з пробою, як фореПоказники та одиниці виміру рішення затичним середовищем, і анодом встановлювали дачі капілярну трубку, а за нею розміщували пробірку з Чутливість визначення рибоксину в електролітом Перед підведенням електричного ЗО живлення (близько 20кВ) в порожнині капіляра пробі, нг/ мл утворювали тиск біля ЗОмБар, що сприяло потраСтупінь екстракції рибоксину, % 100 плянню аналізату в замалий перетин капілярної Загальна тривалість підготовки 7 трубки Після комутації ланцюгів живлення нейтпроби, хв ральні молекули рибоксину під впливом електричТермін аналізу, хв 7 ного струму рухались до анода у форетичному Термін виходу рибоксину, хв 5 середовищі крізь капіляр На довжині хвилі детекЗагальна вартість обладнання, ум тора 254нм, що контактував із капілярною труб11000 од ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71