Спосіб експрес-діагностики сказу

Спосіб експрес-діагностики сказу шляхом послідовного одержання флуоресціюючих кеньюгатів, який відрізняється тим, що останні отримують з антирабічного імуноглобуліну із плазми крові донорів, імунізованих шактивованою концентрованою культуральною антирабічною вакциною, з'єднують з люмінуючим барвником, наносять на досліджуваний матеріал і за наявності специфічної люмінесценції виявляють антиген вірусу сказу Винахід відноситься до галузі медицини і призначається для експрес-діагностики сказу Відомо, що Україна належить до територій небезпечних за сказом ДІЮЧІ СТІЙКІ природні вогнища цієї інфекції активно функціонують не тільки на всій її території, але й за її межами [1, 2] Для діагностики сказу використовують біологічну пробу на мишах, метод мікроскопи мазків та ГІСТОЛОГІЧНИХ зрізів, реакцію зв'язування комплементу, прижиттєві методи, сучасні імуноензиматичні дослідження, імунопреципітацію в агаровому гелі [3 - 10] Усі ЦІ методи характеризуються подовженим терміном виконання, високою вартістю робіт, необхідністю складного устаткування та коштовних реактивів Найбільш точним, швидким та порівняно дешевим у виконанні з існуючих методів діагностики сказу s метод імунофлуоресценцм, завдяки якому в абсолютної більшості випадків можна встановити діагноз на протязі від декількох хвилин до декількох годин Комітет експертів ВООЗ /1994/ вважав швидким та чутливим методом діагностики сказу у тварин та людини метод флуоресціюючих антитіл і рекомендує за його допомогою проводити лабораторну діагностику [11] Дані Світового огляду по сказу /1996/ свідчать, що 28 з 32-х країн, які брали участь у II Міжнародному симпозіумі, використовують тест флуоресціюючих антитіл з діагностичною метою при сказі у людини та 69 з 75-и лабораторій, які працюють в цих країнах, використовують цей тест для діагностики сказу у тварин [12] Прототипом технічного рішення, що пропонується, є спосіб одержання флуоресціюючих конью гатів шляхом імунізації кролів очищеним антигеном вірусу сказу [13] Кон'югати вдержували після чотириразової імунізації кролів очищеним інактивованим вірусом сказу /CVS - 27/ з інтервалами в 1 тиждень та послідуючої дворазової імунізації живим вірусом сказу з тим же проміжком Глобулінову фракцію крові імунізованих кролів мітили ізоціанатом флуоресцеїну Титр віруснейтралізуючих антитіл складав > 1 5000 Оптимальними розведеннями кон'югатів для використання у реакції імунофлуоресценцм були 1 510-1 570 Наведене технічне рішення мав ряд недоліків імунізація кролів вірусами сказу [3 вкрай небезпечшю і петребуе особливих умов щодо техніки безпеки роботи, кон'югат флуоресцеїну є ксеногенним в умовах діагностики гідрофобії великі розведення кон'югату безумовне знижують чутливість діагностики В основу винаходу поставлено задачу створити швидкий метод діагностики сказу в Україні та водночас удосконалити технічне рішення, що пропонується прототипом, шляхом заміни у способі роботи з живими вірусами на вакцинні препарати та заміни кролячого імуноглобуліну на донорський Поставлена задача досягається послідовним одержанням флуоресціюючих кон'югатів, які отримують з антирабічного імуноглобуліну плазми крові донорів, Імунізованих шактивованою концентрованою культуральною антирабічною вакциною, з'єднують з люмінуючим барвником, наносять на досліджуваний матеріал і за наявності специфічної люмінесценції виявляють антиген вірусу сказу ю (О 46195 Алогенний антирабічний імуноглобулін одерНВО "Імунопрепарат" /м Уфа/ Марковані скельця жують з донорської антирабічної плазми, імунізувисушували на повітрі за кімнатної температури, ючи чотириразове донорів концентрованою кульпотім фіксували та промивали фізіологічним розтуральною антирабічною вакциною /схема - 0, 7, чином хлориду натрію На мазки наносили різні 15, ЗО доба/ Плазму фракціонують за методом розведення антирабічного люмінуючого імуноглоКона згідно з діючим регламентом виробництва 10 буліну серії 10799/суцільний, 1 5, 1 10/ Скельця -16% розчину імуноглобуліну з донорської плазми витримували у вологій камері за кімнатної температури впродовж 20хв, потім послідовно відмиА саме виділяють осад білків фракцій II + III, вали від надлишку Імуноглобуліну у забуференому який містить гама-глобулінову фракцію Проводять фізіологічному розчині натрію хлориду та дистийого переосадження, відокремлюючи фракцію II, з льованій воді, після чого висушували на повітрі якої потім висалюють гама-глобулін Отриманий Дослідження препарату проводили за допомогою 10% розчин білку піддають діафільтрацм та стерилюмінесцентного мікроскопу в імерсійній системі лізуючій фільтрації, розливають в ампули та люУ разі яскраво-зеленої дифузної люмінесценції в філізують [14] Алогенний антирабічний імуноглотяжах білка судили про наявність антигенів вірусу булін з'єднують з люмінуючим барвником і викорисказу Результати особистих досліджень подано в стовують для діагностики сказу таблиці 1 Ознаками, що відрізняють винахід, є 1 Використання комерційного /стандартного/ За даними табл 1 найбільшими антигенними антигену для імунізації донорів - концентрованої властивостями характеризувалася КОКАВ с 117, культуральної антирабічної вакцини яка при взаємодії зі специфічним люмінуючим імуноглобуліном /як суцільним, так і в розведенні 1 2 Відпрацьована схема імунізації донорів, яка 5/ давала більш виразну люмінесценцію /+ + + +/ забезпечує вироблення віруснейтралізуючих антиВакцини КОКАВ с 111 та КАВ с 10 були помірними тіл у високих титрах для одержання високоспециза антигенними властивостями, що проявлялося фічної антирабічної плазми слабким СВІТІННЯМ /+ +/ та /+/, як у разі викорис3 Використання існуючого виробництва претання суцільного імуноглобуліну, так і в різних розпаратів імуноглобулінів на станціях переливання веденнях Тому для подальшої роботи в якості крові для одержання високоспецифічного алогенматеріалу, що містить антиген, було відібрано КОного антирабічного імуноглобуліну з антирабічної КАВ с 117 донорської плазми 4 При потребі алогенний антирабічний імуноПриклад 2 Досліджували люмінесценцію антиглобулін поряд з лікувальною метою можливо вигенів вірусу сказу за допомогою люмінуючого імукористовувати для експрес-діагностики гідрофобії ноглобуліну с 20799 /габл 2/ та сказу, з'єднавши з люмінуючим барвником Вакцину наносили, фіксували та забарвлювали люмінуючим імуноглобуліном аналогічно 5 При використанні запропонованого люмінуприкладу 1 Спостерігали люмінесценцію за допоючого препарату діагностика гідрофобії здійснюмогою суцільного діагностичного імуноглобуліну /+ ється в алогенній системі, що підвищує її специфі+ + +/та у розведенні 1 5 /+ + + +/ чність та чутливість Суть винаходу характеризується конкретними Приклад, 3 Досліджували люмінесценцію анприкладами Приклад 1 Донорів імунізують інактигенів вірусу сказу за допомогою люмінуючого тивованою концентрованою культуральною антиантирабічного імуноглобуліну с 30799 /габл 2/ рабічною вакциною /КОКАВ/ 3 плазми крові отриВакцину наносили, фіксували та забарвлювали мують алогенний антирабічний імуноглобулін із аналогічно прикладу 1 Спостерігали люмінесценспецифічними антитілами не менше, ніж 1 50000 тне СВІТІННЯ антигенів при нанесенні на КОКАВ /400МО/ суцільного діагностичного імуноглобуліну /+ + +/ та у розведеннИ 5 - 1 10/+ + +/ 2 % розчин антирабічного імуноглобуліну у карбонатно-бікарбонатному буфері з'єднують з ізоТаким чином, розроблено та досліджено три ціанатом флуоресцеїну за допомогою магнітної серії люмінуючого антирабічного імуноглобуліну, мішалки на протязі 18 - 20год за температури 4°С який може бути використано для експрес-діагносіз розрахунку 0,03 - 0,05мг на 1мг білка Кінцеву тики сказу та гідрофобії в реакції імунофлуоресцеконцентрацію в кон'югаті "білок-барвник" визначанцм ють за допомогою спектрофотометру Кон'югат "білок-барвник" розділяють на колонці з сефа-дексом G-200 або G-50 за допомогою Таблиця 1 0,01 М фосфатно-буферного фізіологічного розВивчення антигенних властивостей різних серій чину натрію хлориду на дві фракції Фракція І ораконцентрованої та культуральної антирабічних нжево-зеленого кольору являє собою люмінуючии вакцин у реакції антиген-антитіло за допомогою антирабічний імуноглобулін Фракція II - залишки люмінуючого антирабічного імуноглобуліну барвника, що не зв'язався з білком Облік специфічного СВІТІННЯ вакРозведення Люмінуючии імуноглобулін розливають по цинних препаратів, серії імуноглобуліну 1,0мл в ампули або скляні флакони, люфілізують 111/К375/ 117/К1416/ 10/К878/ або зберігають у замороженому стані суцільний ++ + +++ ++ Активність 3-Х серій люмінуючого антирабіч1 5 + + +++ + ного імуноглобуліну досліджували в експерименті 1 10 + + + На предметному склі готували мазки з КОКАВ серій 117/К1416/, 111/К375/ та культуральної антирабічної вакцини /КАВ/ серп 10/К878/ виробництва 46195 туальные вопросы вирусных инфекций" АлмаАта, 1973 - С 158-159 Таблиця 2 7 Шашенько А С , Ковалев Н К Лабораторный Вивчення специфічного СВІТІННЯ люмінуючого анметод прижизненной диагностики бешенства//Матер Республ научно-практ конфер по тирабічного імуноглобуліну серій 20799 та 30799 зоонозным инфекциям Минск, 1974 - С 64 - 65 8 Ботвинкин А Д , Чернов С М , Матвеев Л Э Препарат імуноглобуліну Інтенсивність специПрименение иммуноферментных методов в диагфічного СВІТІННЯ серія розведення ностике бешенства//Природно-очаговые болезни ++++ суцільний человека Сб статей, Омск, 1986 - С 12 - 22 20799 ++++ 1 5 9 Ботвинкин А Д , Чернов С М , Грибанова Л Я + 1 10 Обнаружение вируса бешенства в головном мозге +++ суцільний и слюнных железах животных с помощью имму30799 +++ 1 5 ноферментного метода//Вопр вирусологии 1987 +++ 1 10 №6 -С 747-750 Література 1 Бережнов С П , Падченко А Г Аналітичний огляд інфекційної захворюваності в Україні за II МІСЯЦІВ 1998 року//Сучасні інфекції - 1999 - №1 С5-15 2 Шестопалов А М , Аксенов В И , Рассадкин Ю Н , Устинова Е Н Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области//Журн микробиол , эпидемиол и иммунобиологии -1999 - №6 - С 83 - 84 3 Kaplan M , Koprowsdm H , Методы лабораторных исследований по бешенству/ВОЗ, Женева, 1975 -С 73-80 4 Коломакин Г А , Баринова Т Д , Смирнова М М , Тимонина М С Комплексная диагностика бешенства//Вопр вирусологии 1968 - №4 - С 470 474 5 Анина-Радченко Н Д К вопросу о применении реакции связывания комплемента для диагностики бешенства//Симпозиум по бешенству М , 1972 -С 123-124 6 Коломакин Г А , Тимонина М С Материалы к прижизненной диагностики бешенства//В сб "Ак 10 Лейбензон А С , Малахова Т С Применение иммуно-преципитации в агаровом геле для ускоренной диагностики бешенства в лабораторных условиях//Вирусы и вирусные заболевания Сб статей, К "Здоров'я", 1977 - Вып 5 - С 106 -107 11 Комитет экспертов ВОЗ по бешенству/Серия технических докладов, Женева, 1994 -117с 12 World Survey of Rabies №30 for the year 1994/World Healtn Organization Devision of Emerging anil ofn Communicable Deseases Surveillance and Control -1996 - p 13 Тримарчи С , Деббис Дж Получение флуоресцирующих коньюгатов путем иммунизации кроликов очищеным антигеном вируса бешенства/Бюлл ВОЗ, 1975 - Т 51 - №5 - С 431 - 432 14 А с №1745257 СССР, МКИА6ІК39/205, G01 N33/531 Способ получения антирабического иммуноглобулина/Е А Федоровская, А П Рыбальская, М А Селимов, В Ф Соболев, А А Шинкаренко, В П Логвинова - Опубл 07 07 92, Бюл №25 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71