Спосіб експрес-діагностики дифтерії

Спосіб експрес-діагностики дифтерії шляхом люмінесценції, який відрізняється тим, що алогенний донорський антидифтерійний імуноглобулін з'єднують з люмінуючим барвником, цей комплекс наносять на досліджуваний матеріал і за наявності специфічної люмінесценції визначають збудника дифтерії. (19) (21) 99052668 (22) 13.05.1999 (24) 15.02.2001 (46) 15.02.2001, Бюл. №1, 2001 р. (72) Федоровська Олена Олексіївна, Степанчук Валентин Андрійович, Рибальська Алла Петрівна, Мельник Олена Анатоліївна (73) Київський науково-дослідний інститут гематології та переливання крові МОЗ України 34010 крові та підприємствах бактерійних препаратів України. Суть винаходу характеризується конкретними прикладами. Приклад 1. Отримують алогенний антидифтерійний імуноглобулін із специфічними антитілами не менше, ніж 50,0х10,03 МО/л [II]. 2 % розчин антидифтерійного імуноглобуліну у карбонатно-бікарбонатному буфері (рН 9,0) з'єднують з ізоціанатом флуоресцеїну за допомогою магнітної мішалки протягом 18-20 год. за температури 4°С із розрахунку 0,03-0,05 мг на 1 мг білка. Кінцеву концентрацію у кон'югаті "білок-барвник" визначають за допомогою спектрофотометру. Кон'югат "білок-барвник" розділяють на колонці (300х15 мм) з сефадексом G-200 або G-50 за допомогою 0,01 М ФБР на дві фракції. Фракція І оранжевого кольору являє собою люмінуючий антидифтерійний імуноглобулін. Фракція II - залишки барвника, що не зв'язалися з білком. Люмінуючий антидифтерійний імуноглобулін розливають по 1,0 мл у скляні флакони, ліофілізують або зберігають у замороженому стані. У хворого з клінічним діагнозом "дифтерія?" стерильним ватним тампоном беруть мазки з носоглотки і висівають на диференціально-діагностичне поживне середовище. Через 18-24 години з культури мікрорганізмів готують мазки на склі, фламбірують та з'єднують з антидифтерійним люмінуючим імуноглобуліном у розведенні 1:5. Мазки витримують у вологій камері, відмивають послідовно від надлишку імуноглобуліну у забуференому фізіологічному розчині натрію хлориду і дистильованій воді, після чого висушують на повітрі. Дослідження препарату проводять за допомогою люмінесцентного мікроскопу в імерсійній системі. У разі яскраво-зеленої люмінесценції бактерій на темному фоні мазка роблять висновок про наявність Соr. diphtheriae. Приклад 2. У хворого з ЛОР-патологією стерильним ватним тампоном беруть мазки з носоглотки і висівають на диференціально-діагностичне поживне середовище. Через 18-24 години з культури мікроорганізмів готують мазки на склі, фламбірують та з'єднують а антидифтерійним люмінуючим імуноглобуліном аналогічно прикладу 1. Під час мікроскопії мазків у люмінесцентному мікроскопі на темному фоні спостерігають нелюмінуючі темні клітини-тіні Staph. aureus та Strept. sp. Приклад 3. В умовах бактеріологічної лабораторії суспендують [21+З)-годинні культури Соr. diphtheriae, Staph. Aureus та E.coli. Готують мазки на склі, фламбірують та з'єднують з люмінуючим антидифтерійним імуноглобуліном аналогічно прикладу І. Під час люмінесцентної мікроскопії мазків на темному фоні спостерігають яскраво-зелені люмінуючі клітини Соr. diphtheriae та типові за формою нелюмінуючі клітини-тіні Staph. aureus і E.coli. Результати експериментів по вивченню люмінесценції Соr. diphtheriae під впливом люмінуючого антидифтерійного імуноглобуліну представлені в таблиці. Як видно з даних таблиці, після обробки асоціації мікроорганізмів, що складалася з культур Соr. diphtheriae gravis (токсигенної та нетоксигенної), Соr. diphtheriae mitis (токсигенної та нетоксигенної), а також контрольних культур Staphelococeus aureus 209 та Escherichia coli спостерігали наявність або відсутність люмінесценції в залежності від виду мікроорганізму. Так у всі х чотирьох штамів Соr. diphtheriae спостерігали більш виражену люмінесценцію (++++) та (+++) під впливом усіх трьох серій препарату в розведенні 1:5. Менш виражена люмінесценція (++) була під впливом імуноглобуліну в розведeнні 1:10. В той же час у культурах Staph. aureus та E.coli люмінесценція була відсутня. Таким чином, наведені матеріали свідчать про те, що спосіб експрес-діагностики дифтерії значно прискорює постановку діагнозу, є високоспецифічним та доступним для використання в умовах бактеріологічних лабораторій. ЛІТЕРАТУРА 1. Крамарьов С.О., Трішкова Л.О., Богатирьова С.О. та інш. Носійство токсигенних коринебактерій дифтерії у дітей // Інфекц. хвороби. 1995. - № 2. - С.32-33. 2. Гринчук В.И. Вопросы патогенеза, клиники, своевременной диагностики дифтерийного поражения ЛОР-органов // Вестник оториноларингологии. - 1996. - № І. - С. 5-13. 3. Сердюк А.М. Стан і перспективи боротьби з керованими інфекціями в Україні // Інфекц. хвороби. - 1997. - № І. - С.5-9. 4. Kuster H. Untersuchungen mit dem Fluoreszenz mikroskop //Dtsch. Klin.Wschr.-1939.-n.5.-p. 92-94. 5. Bachmann W.Uber den fluoresz mikroskopischen nachweis der tuberkelbazillen und anderer Erzeger//Klin. Wschr.-1939.-n.14.-h.624626. 6.Keller. Ch.J. Yereinfachter nachwesis von Tuberkelba-Jillen im Fluoreszenzlicht//Munch.med Wschr.-1939.-P.2024-2028. 7. Зубжицкий Ю.Н. Флуоресцентная микроскопия и ее применение в микробиологической диагностической и лабораторной практике // Важнейшие инфекц.болезни: Тр.Лен.сан. гиг.мед. ин-та. - 1959. - Вып.46. - С.220-243. 8. Подгайская М.О., Елькина А.П. Ускоренная диагностика дифтерии с применением люминесцентной микроскопии // Лаб.дело. -1961. - № 5. С.51-53. 9. Mood y M., Jones W. Identification of corynebacterium difteriae with fluorescent antibacterial reagent//J.Bacteriol.-1963.-V.86, №2.-P.285-293. 10. Шапіро A.В., Василенко Л.Г., Васіна A.Г. Експрес-діагностика дифтерії по соматичному антигену // Пробл.діаг.,лік.і профіл.інфекц.хвороб: Тез.доп.4-го з'їзду інфекц. України. -К., 1993. С.81-82. 11. Патент 22426 А Україна, МПК G 01 N 33/531, А 61 К 35/395. Спосіб одержання антидифтерійного імуноглобуліну / Перехрестенко П.М., Федоровська 0.0., Назарчук Л.В., Мельник О.А Степанчук В.А., Погодаєва Л.К. (Україна). № 95062955, Заявл.23.06.95; Затв.03.03.98. 2 34010 Таблиця Люмінесценція тест-штамів мікроорганізмів в асоціації, оброблених люмінуючим антидифтерійним імуноглобуліном Імуноглобулін серія пре- pобочі Соr. Diphtheriae парату, № розвеgravis дення токсигенний 1 1:5 ++++ 1:10 +++ 2 3 1:5 1:10 1:5 1:10 ++++ ++ +++ ++ Ступінь люмінесценції тест-культур Соr. Diphtheriae Соr. Diphtheriae Соr. Diphtheriae gravis mitis mitis не токсигенний токсигенний не токсигенний ++++ ++++ ++++ +++ ++ ++ ++++ ++ +++ ++ ++++ ++ +++ ++ ++++ ++ +++ ++ Примітка: + відзначається різний ступінь люмінесценції; - відсутність люмінесценції. ____________________________________________ ДП “Український інститут промислової власності” (Укрпатент) Бульв. Лесі Українки, 26, Київ, 01133, Україна (044) 254-42-30, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид.арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ Вул. Горького, 180, Київ, 03680 МСП, Україна (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3 Exherichia Staphylococoli ceus aureus 209 34010 4