Спосіб одержання напівсинтетичного інсуліну людини

Спосіб одержання напівсинтетичного інсуліну людини, який включає транспептидацію свинячого інсуліну з супутніми спорідненими домішками у водно-органічному середовищі, інгібування реакції зниженням рН, очищення ефіру інсуліну людини, зняття захисних груп і кристалізацію інсуліну людини, який відрізняється тим, що транспептидацію проводять ди-трет-бутиловим ефіром треоніну за його молярного надлишку від більш ніж 100 до 500 та за масового співвідношення трипсину до свинячого інсуліну, що складає 1:(300-1000), здійснюють додаткове інгібування реакції розбавленням реакційної суміші водою в 2-3 рази, а очищення ефіру інсуліну людини і кристалів інсуліну людини, одержаних після зняття захисних груп і прямої кристалізації інсуліну людини, проводять рідинною хроматографією високого тиску. Винахід стосується галузі біохімії та фармації і може бути використаним у біохімічних, імунологічних та біологічних дослідженнях, а також при виробництві препаратів інсулінів для терапевтичних цілей. Відомі способи одержання напівсинтетичного інсуліну людини з свинячого інсуліну та з свинячого інсуліну з супутніми спорідненими домішками шляхом обробки початкової сировини надлишком ефіру треоніну в присутності трипсину у водному середовищі за рН нижче ізоелектричної точки (патент №4 601 852, США, 1993р.) або з тієї ж початкової сировини з використанням комбінації двох типів ферментів: карбоксіпептидази А та з наступним приєднанням ді-трет-бутилового ефіру треоніну, який каталізується трипсином у вільному або імобілізованому стані (Hoppe Seylers, Z. Physiol, Chem. 356, 1631). Недоліками цих способів є утворення проміжного продукту типу Des-(Аsp.sup.А21)-інсулін, який має низьку біологічну активність, і досить низький вихід кінцевого продукту за рахунок розщеплення зв'язку Arg.sup.B22-Gly.syp..B23 трипсином у водному середовищі. Найбільш близьким до даного винаходу за технічною суттю та результатом, який досягається, є спосіб одержання напівсинтетичного інсуліну людини, який включає утворення ефіру інсуліну людини транспептидацією свинячого інсуліну з супутніми спорідненими домішками надлишком третбутилового ефіру треоніну у водно-органічному середовищі в присутності трипсину та органічної кислоти. Ця реакція транспептидації проводиться за молярного надлишку трет-бутилового ефіру треоніну по відношенню до свинячого інсуліну більше ніж 5 і за вагового співвідношення трипсину і свинячого інсуліну від 1 до 1-200. Інгібування реакції здійснюється створенням кислого середовища з рН3, очищення одержаного ефіру інсуліну людини проводиться аніонною та/або катіонною хроматографією, зняття захисних груп виконується відомим способом трифтороцтовою кислотою, після чого проводиться кристалізація сирого інсуліну людини. Умови проведення реакції-кількість води у (19) UA (11) 46667 (13) (21) 2001129230 (22) 29.12.2001 (24) 16.01.2006 (46) 16.01.2006, Бюл. № 1, 2006 р. (72) Лазарєв Олексій Павлович, Пояркова Світлана Олексіївна, Луців Володимир Романович, Гавриш Олег Геннадійович, Мельник Валерій Миколайович, Рибачук Валентина Миколаївна, Стадник Віктор Іванович, Власенко Микола Миколайович, Соляник Людмила Павлівна, Сологуб Павло Павлович, Прудієв Дмитро Павлович, Лесик Ігор Павлович, Оксамитний Віктор Миколайович, Поліванов Анатолій Валентинович, Коноваленко Вадим Анатолійович (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ "МАКО" (56) US 4343898 A, 10.08.1982 US 4320196 A, 16.03.1982 US 4601979 A, 22.07.1986 C2 1 3 46667 4 реакційній суміші - більш ніж 10% і менш ніж 50% Необхідність виконання таких операцій також усуоб'ємних, температура реакції - менше 50°С (павається завдяки прямій кристалізації і після зняття тент №4 343 898, США, С12Ρ021/04). захисних груп. Даний спосіб дозволяє одержати вихід ефіру Окрім того, використання системи ВЕРХ доінсуліну людини, який визначає вихід кінцевого зволяє ефективно відокремити ефір інсуліну люпродукту, більш ніж 60%-90%, але і йому притадини від свинячого інсуліну, який не прореагував, манний той же недолік - при використанні ферта домішок-супутників реакції транспептидації. мент-субстратного співвідношення від 1 до 1-200 в Заключне очищення вже кінцевого продукту умовах проведення реакції транспептидації утвоінсуліну людини, який одержується після зняття рюються домішки (до 7%), які неможливо усунути захисних груп відомим способом трифтороцтовою на наступних стадіях одержання інсуліну людини кислотою та прямої кристалізації сирого інсуліну відомими способами, внаслідок чого одержується людини, також проводиться на колонці системи кінцевий продукт, контамінований цими домішкависокоефективної рідинної хроматографії і дозвоми. Окрім того, даний спосіб є трудомісткім та баляє досягти ще кращих результатів. гатостадійним. Умови реакції транспептидації (ферментЗавданням винаходу, який заявляється, є субстратне співвідношення та молярний надлишок створення способу одержання напівсинтетичного ді-трет-бутилового ефіру треоніну), які відзначаінсуліну людини, який гарантує підвищення виходу ють рішення, що заявляється, дозволяють збільефіру інсуліну людини внаслідок реакції транспепшити ступінь конверсії свинячого інсуліну або вихід тидації, зменшення кількості домішок у кінцевому ефіру інсуліну людини до 98% та зменшити кільпродукті, які важко усуваються, і забезпечення кість домішок, котрі важко усуваються, до 1,5%. На таким чином одержання належного для терапевще більший ступіть усунення домішок спрямоване тичного застосування біохімічно активного, імуноі додаткове очищення кінцевого продукту систелогічно безпечного інсуліну людини та спрощення мою ВЕРХ - до 0,9%. вже існуючого способу за рахунок скорочення кільДля постадійного контролю способу одержанкості операцій. ня напівсинтетичного інсуліну людини, оцінки кінПоставлене завдання вирішується тим, що рецевого продукту та його ідентифікації були викоакцію транспептидації свинячого інсуліну з супутристані аналітичні методики ВЕРХ, пептидного німи спорідненими домішками проводять у воднокартування та імуноферментного аналізу. органічному середовищі за молярного надлишку Вирішення поставлених завдань ілюструється ді-трет-бутилового ефіру треоніну від більш ніж прикладами конкретного виконання. 100 до 500 і за вагового співвідношення трипсину і Приклад 1 свинячого інсуліну від 1 до 300-1000, здійснюють 100мг сирого свинячого інсуліну суспендували додаткове інгібування реакції розбавленням реакв 0,4мл води, додавали 0,05мл оцтової кислоти, ційної суміші водою у 2-3 рази, очищення одержа3мл 0,63Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в ного ефіру інсуліну людини проводять рідинною суміші діметілацетаміду та 1,4 бутандіолу, 0,25мг хроматографією високого тиску і після зняття затрипсину в 0,2мл 0,05 Μ кальцію ацетату, реакційхисних груп виконують пряму кристалізацію інсуліну суміш перемішували протягом 16 годин за темну людини і його заключне очищення аналогічним ператури 23°С. Реакцію інгібували розбавленням чином. водою у два рази по відношенню до об'єму реакУ якості почасткової сировини у способі, який ційної суміші і рН суміші доводили до 2,5 10% НСl. заявляється, використовують свинячий інсулін з Аналіз реакційної суміші показав, що вихід ефірної супутніми спорідненими домішками, такими як похідної інсуліну складав 98%. Розбавлену реаксвинячий проінсулін (до 2%) та продукти модифіційну суміш фільтрували через фільтр з розміром кації і деградації свинячого інсуліну. Такий інсулін пор 0,2мкм для нанесення на колонку системи ще називається сирим інсуліном. ВЕРХ. В якості нерухомої фази використовували Водно-органічне середовище являє собою восорбент DAISOGEL ODS-AP (С-18) з розміром чаду з сумішшю апротонних (наприклад, діметілацесток 15мкм і розміром пор 120А. Для рухомої фази тамід, діметілсульфоксид) та протонних (напривикористовували 0,06 Μ гліцин-НСІ буфер, який клад, 1,2 етандіол, 1,4 бутандіол, 1,5 пентадіол) містив 0,015 Μ амонію сульфату і пропанолу-2 з розчинників. концентрацією від 20 до 35% за рН 2,5. Фракцію Трипсин у представленому технічному рішенні ефірної похідної осаджували в присутності іонів може бути свинячим або бичачим. цинку за рН від 6,8 до 7,0, центрифугували, одерВ реакції транспептидації може використовужаний осад промивали водою та сушили у вакуумватися ді-трет-бутиловий ефір треоніну або його ній сушильній шафі. 82мг одержаного ефіру інсусіль. ліну людини розчиняли в 1,0мл трифтороцтової Додаткове інгібування реакції транспептидації кислоти, витримували суміш протягом 40 хвилин розбавленням реакційної суміші водою в 2-3 рази за температури 25°С, трифтороцтову кислоту віддозволяє безпосередньо наносити розбавлену гонили на роторному випарнику за температури не суміш на колонку системи рідинної хроматографії вище ніж 30°С, одержаний залишок сирого інсуліну високого тиску або, як вона ще називається, сислюдини розчиняли у воді і проводили пряму циттеми високоефективної рідинної хроматографії ратну кристалізацію за рН 5,8. (ВЕРХ), що усуває необхідність виконання ряду Кристалічну суспензію фільтрували, кристали технологічних операцій, які описані в прототипі, промивали водою, розчиняли в 0,25Μ оцтовій кистобто: осадження реакційної суміші,відокремленлоті та наносили на колонку системи ВЕРХ. В яконя осаду центрифугуванням, розчинення осаду. сті рухомої фази використовували 0,05 Μ ацетат 5 46667 6 ний буфер, який містив пропанолу-2 від 10 до 20% ту. Реакційну суміш перемішували протягом 20 за рН 2,5. Фракцію інсуліну людини кристалізували годин за температури 20°С. Вихід ефіру інсуліну за рН 5,8, суспезію кристалів фільтрували, промилюдини склав 70%, а кількість свинячого інсуліну, вали водою та ліофільно висушували. Вихід інсуякий не прореагував, дорівнювала 10%. ліну людини склав 75мг. Методом пептидного карПриклад 6 тування було беззаперечно доведено, що цей 100мг сирого свинячого інсуліну суспендували продукт є дійсно інсуліном людини. Потім методом в 0,4мл води, додавали 0,06мл оцтової кислоти, імуноферментного аналізу було встановлено, що 3мл 0,51 Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в залишок свинячого проінсуліну у кінцевому продусуміші діметілацетаміду та 1,5 пентадіолу. Далі кті складає менше 1мкг/г, що відповідає фармакочинили, як в прикладі 1. Вихід ефіру інсуліну люпейним вимогам, згідно з якими вміст свинячого дини за даними аналітичної ВЕРХ склав 70%. Кіпроінсуліну у інсуліні людини повинен становити лькість свинячого інсуліну, який не прореагував, не більше 10мкг/г. Щодо інших споріднених домідорівнювала 20%. шок, то за допомогою аналітичної системи ВЕРХ Приклад 7 був встановлений їх вміст - не більше 0,85%. 60мг сирого свинячого інсуліну суспендували в Приклад 2 0,24мл води, додавали 0,045мл оцтової кислоти, 50мг сирого свинячого інсуліну суспендували в 1,8мл 3,0Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в 0,2мл води, додавали 0,025мл оцтової кислоти, суміші діметілацетаміду та 1,4 бутандіолу, 0,06мг 1,5мл 0,858 Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в трипсину в 0,12мл 0,05 Μ кальцію ацетату. Реаксуміші діметілацетаміду та 1,5 пентадіолу, ційну суміш перемішували протягом 26 годин за 0,165мг трипсину в 0,1мл 0,05 Μ кальцію ацетату. температури 25°С. Далі чинили, як в прикладі 7. Реакційну суміш перемішували протягом 23 годин Вихід ефіру інсуліну людини склав 80%. за температури 18 °С. Далі чинили, як в прикладі Приклад 8 1, але реакційну суміш розбавляли водою у три 50мг свинячого проінсуліну суспендували в рази по відношенню до об'єму реакційної суміші. 0,25мл води, додавали 0,022мл оцтової кислоти, Вихід ефіру інсуліну людини склав 40,5мг, вміст 1,5мл 0,7Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в супутніх споріднених домішок 0,8% . суміші діметілацетаміду та 1,4 бутандіолу, 0,17мг Приклад 3 трипсину в 0,1мл 0,05Μ кальцію ацетату. Умови 75мг сирого свинячого інсуліну суспендували в проведення реакції були, як в прикладі 4. Реакцій0,3мл води, додавали 0,04мл оцтової кислоти, ну суміш осаджували 10 об'ємами ацетону і вису2,25мл 1,14Μ ді-трет-бутилового ефіру треоніну в шували. Аналіз осаду за даними ВЕРХ показав суміші діметілсульфоксиду та 1,2 етандіолу, 85% вихід ефірної похідної інсуліну людини. 0,08мг трипсину в 0,15мл 0,05 Μ кальцію ацетату. Таким чином, як показують приклади конкретДалі чинили, як в прикладі 1. Вихід ефіру інсуліну ного виконання, застосування способу, який заявлюдини за даними аналітичної ВЕРХ склав 97%. ляється, забезпечує підвищення виходу ефіру інАналіз кінцевого продукту показав, що вміст в нім суліну людини до 98% і зменшення вмісту супутніх супутніх споріднених домішок складає 0,84%. споріднених домішок у кінцевому продукті до 0,9% Приклад 4 (приклади 1 - 3). У той же час, як показують прикРеакційна суміш і умови реакції, як в прикладі лади 4, 5, 6 і 7, в яких фермент-субстратне спів2, за виключенням кількості трипсину - трипсину відношення та молярний надлишок ді-третдодавали 0,25мг в 0,1мл 0,05 Μ кальцію ацетату. бутилового ефіру треоніну знаходяться поза меРеакцію проводили протягом 10 годин за темперажами, які заявляються, поставлені завдання щодо тури 23 °С. За даними ВЕРХ вихід ефіру інсуліну якості і кількості вихідного продукту вирішити не людини склав 75%, кількість домішок, які важко вдається. Приклад 8 доводить, що за оптимальних усуваються, дорівнювала 5%. умов проведення реакції транспептидації свинячий Приклад 5 проінсулін, який є домішкою у початковій сировині, Реакційна суміш, як в прикладі 4, за виклюна 85% конвертується в ефір інсуліну людини, що, ченням кількості трипсину. Для реакції використаяк зрозуміло, також сприяє збільшенню виходу ли 0,04мг трипсину в 0,1мл 0,05 Μ кальцію ацетакінцевого продукту. Комп’ютерна верстка M. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601