Спосіб одержання готової лікарської форми інсуліну короткої дії

Спосіб одержання готової лікарської форми інсуліну короткої дії, який включає одержання ефіру інсуліну людини транспептидацією свинячого інсуліну надлишком ди-трет-бутилового ефіру треоніну у водно-органічному середовищі в присутно 3 46666 4 ефіру треоніну по відношенню до свинячого інсусіль. ліну більш ніж 5 та за вагового співвідношення Розбавлення реакційної суміші водою в 2 - 3 трипсину і свинячого інсуліну від 1 до 1-200, потім рази дозволяє безпосередньо наносити розбавлеінгібують реакцію створенням кислого середовища ну суміш на колонку системи рідинної хроматогз pH 3, очищують одержаний ефір інсуліну людини рафії високого тиску або, як вона ще називається, аніонною та/або катіонною хроматографією, знісистеми високоефективної рідинної хроматографії мають захисні групи відомим способом трифторо(ВЕРХ), що спрощує спосіб та усуває необхідність цтовою кислотою, після чого проводять кристалівиконання ряду технологічних операцій, які описазацію сирого інсуліну людини, одержані кристали ні в прототипі, тобто: осадження реакційної суміші, розчиняють в розбавленій кислоті та змішують з відокремлення осаду центрифугуванням, розчирозчинами консерванту, ізотонічного агента та з нення осаду. Необхідність виконання таких операречовинами з буферною ємністю, в якості яких цій також усувається і після зняття захисних груп використовують фенол або m-крезол, гліцерин і завдяки прямій кристалізації. солі фосфорної кислоти (Galenics of Insulin Окрім того, використання системи ВЕРХ доPreparations. J. Brange et.al., стр. 27, 66). Цей спозволяє ефективно відокремити ефір інсуліну люсіб дозволяє збільшити вихід ефіру інсуліну людидини від свинячого інсуліну, який не прореагував, ни, який визначає вихід інсуліну людини в процесі та домішок-супутників реакції транспептидації. виробництва, до 60% (а за певних умов навіть до Заключне очищення на першій стадії процесу 90%) і суттєво знизити кількість шкідливих домішок приготування готової лікарської форми кристалів до (до 7%). інсуліну людини, які одержуються після зняття Але недоліками цього способу все ще зализахисних груп відомим способом трифтороцтовою шаються досить високі імунологічні властивості кислотою та прямої кристалізації, також провопрепарату та значні втрати інсуліну у процесі видиться на колонці системи високоефективної ріробництва. динної хроматографії і дозволяє досягти ще краЗавданням винаходу є створення ефективнощих результатів. го, економічного способу приготування готової Умови реакції транспептидації (ферментлікарської форми інсуліну короткої дії з низькими субстратне співвідношення та молярний надлишок імунологічними властивостями, який гарантує ди-трет-бутилового ефіру треоніну), які відрізнязменшення втрат інсуліну в процесі виробництва. ють рішення, що заявляється, дозволяють збільПоставлене завдання вирішується тим, що у шити ступінь конверсії свинячого інсуліну або вихід способі приготування готової лікарської форми ефіру інсуліну людини, який характеризує вихід інсуліну короткої дії, який включає одержання ефікінцевого продукту семісинтезу, до 98% та зменру інсуліну людини транспептидацією свинячого шити кількість домішок, котрі важко усуваються, до інсуліну надлишком ди-трет-бутилового ефіру тре1,5%. На ще більший ступінь усунення домішок оніну у водно-органічному середовищі в присутноспрямоване і додаткове очищення одержаних кристі трипсину, хроматографічне очищення отримасталів інсуліну людини - до 0,9%. ного ефіру, зняття захисних груп, кристалізацію На другій стадії приготування готової лікарсьінсуліну людини, його наступне розчинення в розкої форми інсуліну короткої дії кристали інсуліну бавленій кислоті та змішування з розчинами конлюдини спочатку суспендують у воді і для одерсерванту, ізотонічного агента та речовинами з бужання дрібнодисперсної суспензії добре переміферною ємністю, реакцію транспептидації шують, а потім додають до неї 1М НСl. Приготупроводять за молярного надлишку ди-третвання дрібнодисперсної суспензії на першому бутилового ефіру треоніну від більш ніж 100 до етапі, тобто коли кожна окрема дрібна частка інсу500 та за вагового співвідношення трипсину і свиліну виявляється вже з усіх боків оточеною водою, нячого інсуліну від 1 до 300 - 1000, потім розбавстворює умови для їх швидкого розчинення у розляють реакційну суміш водою у 2 - 3 рази і провобавленій кислоті на другому етапі. Таким чином, дять очищення рідинною хроматографією високого час контакту кристалів інсуліну з кислотою зментиску ефіру інсуліну людини та інсуліну людини, шується, що призводить, згідно з дослідженнями одержаного після прямої кристалізації, наступне авторів, до зменшення кількості А21-дезаміду інрозчинення кристалів інсуліну в розбавленій киссуліну, що утворюється, а отже до збільшення чилоті проводять поетапно, причім спочатку одерстоти препарату. жують дрібнодисперсну суспензію кристалів інсуЯк консервант використовують m-крезол або ліну у воді, а потім до неї додають розбавлену фенол, як ізотонічний та буферні агенти викорискислоту. товують гліцерин та одно- та двозаміщені солі фоСупутніми спорідненими домішками до свинясфорної кислоти. чого інсуліну являються свинячий проінсулін та Вирішення поставленого завдання ілюструєтьпродукти модифікації і деградації свинячого інсуся прикладами конкретного виконання. ліну. Приклад 1 Водно-органічне середовище являє собою во6г сирого свинячого інсуліну суспендували в ду з сумішшю апротонних (наприклад, діметілаце24мл води, додали 3,0мл оцтової кислоти, 180мл тамід) та протонних (наприклад, 1,2 етандіол, 1,4 0,7М ди-трет-бутилового ефіру треоніну в суміші бутандіол, 1,5 пентадіол) розчинників. діметілацетаміду та 1,4 бутандіолу, 19мг трипсину Трипсин у представленому технічному рішенні в 12мл 0,05M кальцію ацетату, реакційну суміш може бути свинячим або бичачим. перемішували протягом 16 годин за температури В реакції транспептидації може використову23°С. Реакцію інгібували розбавленням водою у ватися ди-трет-бутиловий ефір треоніну або його два рази по відношенню до об'єму реакційної су 5 46666 6 міші і pH суміші довели до 2,5 10% НСl. Розбавлепоказали, що її активність складала 38,2МО/мл, ну реакційну суміш профільтрували через фільтр з вміст высокомолекулярных сполук 0,7%, споріднерозміром пор 0,2мкм для нанесення на колонку них супутніх домішок 3,9%, А21-дезаміду інсуліну системи ВЕРХ. В якості нерухомої фази викорис1,5%. тали сорбент DIASOGEL ODS (С 18) з розміром Приклад 3 часток від 15мкм і розміром пор від 100 до 150Ǻ. Умови одержання кристалів інсуліну людини Для рухомої фази використали 0,06M гліцин-НСl та проведення інших операцій по приготуванню буфер, який містив 0,015M амонію сульфату і проготової лікарської форми інсуліну короткої дії, як в панолу-2 з концентрацією від 20 до 35% за pH 2,5. прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії Фракцію ефірної похідної осаджували в присутноспроцесу додали 4,8мг трипсину в 12мл 0,05M каті іонів цинку за pH від 6,8 до 7,0, відцентрифугульцію ацетату, а реакційну суміш перемішували вали, одержаний осад промили водою та висушипротягом 20 годин за температури 20°С. Аналіз ли у вакуумній сушильній шафі. 5,0г одержаного проміжного продукту за допомогою аналітичної ефіру інсуліну людини розчинили в 60мл трифтосистеми ВЕРХ виявив, що кількість супутніх споріроцтової кислоти, витримали суміш протягом 40 днених домішок у ньому дорівнювала 10%. Досліхвилин за температури 25°С, трифтороцтову кисдження готової лікарської форми інсуліну короткої лоту відігнали на роторному випарнику за темпедії згідно з прикладом 3 показали, що її активність ратури не вище ніж 30°С, одержаний залишок сискладала 38,5МО/мл, вміст високомолекулярних рого інсуліну людини розчинили у воді і провели сполук 0,8%, споріднених супутніх домішок 1,5%, пряму цитратну кристалізацію за pH 5,8. А21-дезаміду інсуліну 1,0%. Кристалічну суспензію відфільтрували, крисПриклад 4 тали промили водою, розчинили в 0,25M оцтовій Умови одержання кристалів інсуліну людини кислоті та нанесли на колонку системи ВЕРХ. В та проведення інших операцій по приготуванню якості рухомої фази використали 0,05M ацетатний готової лікарської форми інсуліну короткої дії, як в буфер, який містив пропанолу-2 від 15 до 25% за прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії pH 2,5. Фракцію інсуліну людини кристалізували за процесу додали 180мл 0,51M ді-трет-бутилового pH 5,8, суспензію кристалів відфільтрували, проефіру треоніну в суміші діметілацетаміду та 1,5 мили водою та ліофільно висушили. Методом імупентадіолу. Аналіз за даними ВЕРХ виявив, що ноферментного аналізу було встановлено, що закількість супутніх споріднених домішок у проміжлишок свинячого проінсуліну у отриманому інсуліні ному продукті дорівнювала 18%. Дослідження голюдини становив менше 1мкг/г. Щодо інших спорітової лікарської форми інсуліну короткої дії згідно з днених домішок, то за допомогою аналітичної сисприкладом 4 показали, що її активність складала теми ВЕРХ був встановлений їх вміст - 0,85%. 39,0МО/мл, вміст високомолекулярних сполук Отриманий інсулін людини помістили в 560мл 1,0%, споріднених супутніх домішок 1,9%, А21води, а потім добре перемішали до одержання дезаміду інсуліну 0,8%. дрібнодисперсної суспензії, додали таку кількість Приклад 5 1М НСl, щоб pH розчину був не нижче 3,1. Далі Умови одержання кристалів інсуліну людини приготували буферний розчин з 5,88г натрію фоста проведення інших операцій по приготуванню форнокислого однозаміщеного двоводного в 2,32л готової лікарської форми інсуліну короткої дії, як в води, додали ще 44,8г гліцерину, 7,36г m-крезолу, прикладі 1, за винятком того, що на першій стадії перемішали протягом 30 хвилин і pH суміші довепроцесу додали 180мл 1,29M ді-трет-бутилового ли до 7,8. Далі розчин кристалів інсуліну людини ефіру треоніну в суміші діметілацетаміду та 1,4 змішали з буферним розчином і довели pH до 7,3. бутандіолу. Аналіз за даними ВЕРХ показав, що Об'єм розчину довели водою для ін'єкцій до 2,8л, кількість споріднених домішок у проміжному пропровели його стерилізуючу фільтрацію з наступдукті складає 15%. Дослідження готової лікарської ним розливом в асептичних умовах у флакони та форми інсуліну короткої дії згідно з прикладом 5 картриджі, закупоркою та маркуванням. Досліпоказали, що фармацевтичний препарат має акдження готової лікарської форми інсуліну короткої тивність 38,8МО/мл, вміст високомолекулярних дії за допомогою аналітичної системи ВЕРХ покасполук 0,75%, споріднених супутніх домішок зали, що фармацевтичний препарат має актив1,35%, А21-дезаміду інсуліну 1,1%. ність 39,8МО/мл, вміст високомолекулярних споПриклад 6 лук 0,25%, споріднених супутніх домішок 0,75%, Умови виконання операцій першої і другої стаА21-дезаміду інсуліну 0,3 %. дій процесу приготування готової лікарської форПриклад 2 ми інсуліну короткої дії, як в прикладі 1, за винятУмови одержання кристалів інсуліну людини ком того, що кристали інсуліну безпосередньо та проведення інших операцій по приготуванню розчиняли в розбавленій кислоті. Дослідження готової лікарської форми інсуліну короткої дії, як в готової лікарської форми інсуліну короткої дії згідприкладі 1, за винятком того, що на першій стадії но з прикладом 6 показали, що фармацевтичний процесу додали 30мг трипсину в 12мл 0,05M кальпрепарат має активність 39,3МО/мл, вміст високоцію ацетату, а реакцію проводили протягом 10 молекулярних сполук 0,5%, споріднених супутніх годин за температури 23°С. Аналіз за даними домішок 0,9%, А21-дезаміду інсуліну 2,1%. ВЕРХ виявив, що кількість супутніх споріднених Таким чином, аналіз виконаних прикладів подомішок у кінцевому продукті першої стадії процеказує (приклади 2 - 5), що недодержання діапазосу дорівнювала 4,2%. Дослідження готової лікарнів величин, які заявляються, призводить до погіської форми інсуліну короткої дії згідно з прикларшення характеристик готових лікарських форм та дом 2 за допомогою аналітичної системи ВЕРХ до збільшення втрат інсуліну в процесі виробницт 7 46666 8 ва. Приклад 6 чітко виявляє залежність вмісту кристалів інсуліну у розбавленій кислоті, які заявА21-дезаміду інсуліну, тобто чистоти препарату, ляються (приклад 1), дозволяє приготувати еконовід способу одержання розчину кристалів інсуліну мічнім та вискокоефективним способом готову у розбавленій кислоті. У той же час додержання лікарську форму інсуліну короткої дії зі зниженими діапазонів величин і способу одержання розчину імунологічними властивостями. Комп’ютерна верстка M. Клюкін Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601