Вакцинний штам бактерій bacillus anthracis сб-072 проти сибірки тварин

Вакцинний штам бактерій Bacillus anthracis (Депозитарій Київського філіалу Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів і кормових добавок Міністерства Агропромислового комплексу України, реєстраційний номер СБ 072), що використовують для виробництва вакцини проти сибірки тварин. (19) (21) 98010502 (22) 30.01.1998 (24) 16.10.2000 (33) UA (46) 16.10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (72) Доценко Віктор Васильович, Євдокименко Микола Іванович, Кошарний Василь Михайлович, Ходякова Любов Миколаївна, Достоєвський Павло Петрович, Прискока Віктор Андрійович, Пархоменко Наталія Адольфівна 29201 Морфологія клітин: при мікроскопії пофарбованих за Грамом препаратів виявлені з МПА прямі палички фіолетового кольору (5-8´0,8-1 мкм), поодинокі або у ланцюжках різної довжини; без капсул; спори овальні, безбарвні, утворюються у центрі клітин. Рухливість: палички нерухомі. Морфологія колоній на твердих поживних середовищах: колонії R-форми, сірувато-білі, округлі, опуклі, з хвилястим краєм і зернистою масою всередині. Культуральні особливості на рідких поживних середовищах: за візуальною оцінкою добової культури штаму в МПБ (рН 7,2-7,4): на дні пробірки утворюється білуватий пухкий осад, бульйон над осадом прозорий, плівка і пристінне кільце не утворюються. На середовищі з сироваткою крові великої рогатої худоби: ріст по всьому стовпчику у вигляді хмарок; утворюється значніший осад, ніж на МПБ. Ферментативна активність: ферментує цукрозу, глюкозу з виділенням кислоти без виділення газу; не ферментує маніт, лактозу, мальтозу; знебарвлює метиленову синьку протягом 30 і більше хвилин. При висіванні на кров'яному агарі через 24 години гемоліз відсутній, згодом - наявність зон гемолізу. Чутливість до антибіотиків: найбільш чутливий до еритроміцину, тетрацикліну, левоміцитину, менш чутливий до неоміцину, стрептоміцину. Нечутливий до поліміксину, пеніциліну. Біологічні властивості: при внутрішньочеревному введенні білим мишам масою 18-20 г LD50 складає 12,4-12,6´106 живих мікробних клітин. Підшкірне введення 1 см кролям масою 2-2,5 кг: 170 млн живих мікробних клітин не викликає їх загибелі, а у місці введення спостерігається підвищення температури протягом перших трьох діб і набряки 1´1,5 см, які згодом зникають. Капсулоутворення в органах уражених тварин і на середовищах з сироваткою ГКІ відсутнє. Капсули навколо вегетативних клітин відсутні. При культивуванні штаму Bacillus anthracis СБ 072 поверхневим методом в 4-х літрових бутелях накопичення досягає 1,6-2,0 млрд спор на бутель. Зберігання: культуру запропонованого штаму зберігають у ліофілізованому стані або у вигляді суспензії спор на гліцерині. Запропонований штам уявляє собою нову культуру, яка має особливі властивості. На відміну від прототипу цей штам володіє порівняно низькою вірулентністю, яка характеризується значенням LD50 вище 5,0´106 мікробних живих клітин, а саме: 12,4-12,6´106 живих мікробних клітин при збереженні необхідної імуногенності. При цьому продуктивність штаму при поверхневому культивуванні досягає 2,0 млрд спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Як показали дослідження, поряд з низьким рівнем вірулентності і, відповідно, низьким рівнем реактогенності новий штам володіє вираженою резистентністю до антибіотику - пеніциліну, тобто йому не властива чутливість до пеніциліну. Такі властивості штаму дозволяють поліпшити якість вакцини проти сибірки, розширити спектр можливостей використання вакцини, використовувати в необхідних випадках вакцинацію тварин у поєднанні з їх лікуванням анти біотиками, при цьому відкривається можливість сполучення нечутливості культури штаму до визначеного антибіотику і нечутливості до інших антибіотиків. Запропонований штам є конкурентоспроможнім, його створення дозволяє розширити банк виробничих культур, здійснити перший пріоритетний внесок в формування в Україні національної колекції патентоспроможних сибіркових штамів. Вакцинація тварин проти сибірки на цей час є дуже актуальною. Таким чином, запропонований штам відповідає критеріям "новизна", "винахідницький рівень". Практичне здійснення винаходу ілюструється прикладами. Комплекс експериментально-дослідних робіт з випробуванням штаму в лабораторно-виробничих умовах проведено на базі Сумської біофабрики підприємства спеціалізованого біотехнологічного вакцинного виробництва спільно з представниками Київського філіалу Державного науково-дослідного контрольного інституту ветпрепаратів і кормових добавок Міністерства Агропромислового комплексу України. Приклад 1. Спорову культуру штаму Bacillus anthracis СБ 072 отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ 072 на стерильному живильному середовищі - м'ясо-пептонному агарі в 4-літровій бутелі. Бутель заповнюють живильним середовищем у кількості 150 см на бутель. Таке середовище розподіляють по внутрішній поверхні бутилі тонким шаром з одночасним охолоджуванням середовища. Потім живильне середовище витримують протягом 24 годин при температурі 37±1°С з метою перевірки на стерильність, після чого засівають бактеріальною суспензією Bacillus anthracis СБ 072 і витримують дві доби при температурі 37±1°С, а потім п'ять діб при температурі 32±1°С. Спори, що утворились, змивають з поверхні агару 100 мл стерильної дистильованої води і концентрують до необхідного рівня. Накопичення біомаси нового штаму складає 1,6-1,8 млрд спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99-100%. Для стабілізації кількості мікробних клітин суспензію спор змішують з 30-33% гліцерином. Готову вакцину зберігають при температурі 2-15°С. Отриману культуру штаму Bacillus anthracis СБ 072 випробують на типовість, однорідність, капсулоутворення, залишкову вірулентність, нешкідливість, імуногенність, чутливість до антибіотиків. Ця культура характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культуральноморфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній Rформ не перевищує 5%, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ 072. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20 г, характеризується значенням LD50 12,5´106 живих мікробних клітин. Чутливість до пеніциліну визначають методом паперових дисків з антибіотиками. Цей штам найбільш чутливий до еритроміцину, тетрацикліну, левоміцитину, менше чутливий - до неоміцину, стрептоміцину, нечутливий до поліміксину, пеніциліну. Імуногенність штаму визначають на морських свинках масою 350-400 г, щеплених штамом 2 29201 Bacillus anthracis СБ 072, з наступним контрольним зараженням другою вакциною Ценковського М-71 в летальній дозі. Введення культури штаму Bacillus anthracis СБ 072 у вказаних дозах забезпечує захист 85-90% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Приклад 2. Спорову культуру штаму Bacillus anthracis СБ 072 отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ 072 як у прикладі 1, але на стерильному живильному середовищі ферментативний гідролізат сухого білкового концентрату з побічних продуктів м'ясо-молочних виробництв (ферментативний гідролізат СБК) у співвідношенні з водою, об'єм. % : ферментативний гідролізат СБК - 18, вода - останнє. Культура штаму, яка одержана, характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культурально-морфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній R-форм не перевищує 5 %, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ 072. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20 г, характеризується значенням LD50 12,6´106 живих мікробних клітин. Накопичення біомаси нового штаму складає 1,5-1,8 млрд спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99100%. Культура штаму, яка одержана, найбільш чутлива до еритроміцину, тетрацикліну, левоміцитину, менш чутлива - до неоміцину, стрептоміцину, нечутлива до поліміксину, пеніциліну, їмуногенність штаму визначають на морських свинках масою 350-400 г, щеплених культурою штаму Bacillus anthracis СБ 072, з наступним контрольним зараженням другою вакциною Ценковського М-71 в детальній дозі. Введення культури штаму Bacil- lus anthracis СБ 072 у вказаних дозах забезпечує захист 85-90% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Приклад 3. Спорову культуру штаму Bacillus anthracis СБ 072 отримують шляхом культивування бактерій Bacillus anthracis СБ 072 як у прикладі 1, але на стерильному живильному середовищі ферментативний гідролізат сухого білкового концентрату з побічних продуктів м'ясо-молочних виробництв (ферментативний гідролізат СБК) у співвідношенні з водою, об'єм. % : ферментативний гідролізат СБК - 25, вода - останнє. Культура штаму, яка одержана, характеризується такими параметрами: типовість - типовими для штаму культурально-морфологічними властивостями; однорідність - за типом колоній, кількість дисоційованих колоній R-форм не перевищує 5%, відсутність капсул у мазках - відбитках з органів тварин, що загинули від введення підвищених доз штаму Bacillus anthracis СБ 072. Вірулентність отриманої культури, яка визначена на білих мишах масою 18-20 г, характеризується значенням LD50 12,4´106 живих мікробних клітин. Накопичення біомаси нового штаму складає 1,7-2,0 млрд спор на бутель, при цьому масова частка спор складає 99100%. Культура штаму, яка одержана, найбільш чутлива до неоміцину, стрептоміцину, нечутливий до поліміксину, пеніциліну. Імуногенність штаму визначають на морських свинках масою 350-400 г, щеплених штамом Bacillus anthracis СБ 072, з наступним контрольним зараженням другою вак- циною Ценковського М-71 в летальній дозі. Введення культури штаму Bacillus anthracis СБ 072 у вказаних дозах забезпечує захист 85-90% тварин при 100% загибелі контрольних не щеплених тварин. Порівняльні характеристики нового штаму, які одержали, як показано у прикладах 1, 2, 3, і відомих штамів наведені у табл. 1 і у табл. 2, при цьому дані для табл. 1 отримані методами пробіт- і регресійного аналізів. Таблиця 1 Порівняльна оцінка вірулентності запропонованого та відомих штамів Концентрація ЗагиLD50 Кільспор бель кість тва- МікроШтам тва- Мікрорин, бних lg рин бних клі- lg клітин, % тин в см3 млн 1х105 5 27 СТИ 1х106 6 47 15 1,6 6,2 (аналог) 1х107 7 60 8 1х10 8 100 55 1х107 7 60 ВНИИВ1х108 8 80 5 5,0 5,0 ВиМ (прото2х108 8,3 100 тип) 5,5х106 6,7 25 СБ072 11,5х106 7,1 50 (запро4 12,6 7,1 понова32x106 7,5 75 ний) 86x106 79 100 Таблиця 2 Характеристика чутливості штамів до антибіотиків ВНИИВВиМ Штам СБ 072 55 (прототип) Антибіотик (запропонований) Стерильна Стерильна зона зона Еритроміцин + + Тетрациклін + + Неоміцин + + Левоміцитин + + Стрептоміцин + + Полімексін Пеніцилін + Джерела інформації: 1. ТУУ 46.15.201.97. Вакцина СТЇ жива проти сибірки тварин. 2. Патент № 2056861, Российская Федерация, МПК А61К39/135, заявл. 23.03.1996, опубл. 27.03.1996. 3. ТУ-1009-3-87. Штамм 55-ВНИИВВиМ сибироязвенный вакцинный. 3 29201 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4