Моноклональні антитіла до iga людини, придатні для використання у імуноферментному аналізі

Моноклональні антитіла до IgA людини, придатні для використання у імуноферментному ана 131А9 133G12 136D5 IgG2b IgG1 IgG2b Константа афінності Титр МКАТ у культуральній Титр кон'югату МКАТ з перокМКАТ, 109×моль×л-1 рідині* сидазою хрону** 12,0 1:500 1:200000 10,0 1:1000 1:64000 11,0 1:1000 1:100000 Примітки. * Аналіз культуральних рідин у непрямому твердофазному ІФА при сорбції IgA людини 0,5мкг на лунку. ** Аналіз пероксидазних кон'югатів у прямому твердофазному ІФА при сорбції IgA людини 0,5мкг на лунку. (19) Назва МКАТ Ізотип МКАТ UA Таблиця 1 3 Приклад 1 Одержання асцитичної рідини із вмістом МКАТ 131А9, 133G12, 136D5. Черевину миші Balb/c обробляли спиртом та внутрішньочеревно вводили по 0,5мл пристану (Sigma, США, кат. номер Т7640) за допомогою стерильного скляного шприца на 1мл або 2мл; використовували стерильні голки «Рекорд» 0,5×10-15мм. Мишей витримували 3 тижні. Кріопробірки з замороженими клітинами клонів 131А9, 133G12, 136D5 діставали з судини Дюара із рідким азотом, витримували на повітрі 2-3 хвилини та занурювали у воду із температурою 40°С. Пробірки витримували у воді до тих пір, поки повністю розтане лід. Після цього за допомогою піпетки на 1мл суспензії гібридом переносили у пробірки на 15 мл, повільно додавали 10-15мл середовища HY Medium Hybri-Max™ (Sigma, США, кат. номер Н9014) без сироватки. Центрифугували при 1300об/хв. протягом 3хв. Надосад видаляли, а осад клітин ресуспендували у 10мл середовища H-Y Medium Hybri-Max™ без сироватки. Суспензію переносили у скляний флакон на 15мл та закривали пробкою. Суспензію клітин перемішували та набирали у стерильний шприц по 1,0-1,5мл, вводили у черевну порожнину мишей (справа або зліва від серединної лінії на 1см нижче від реберної дуги), яка за 3 тижні до цього була праймована пристанем. Мишей залишали на 5-15 днів для накопичення у черевній порожнині асцитичної рідини. Через 5-15 днів після введення мишам суспензій гібридом 131А9, 133G12, 136D5 у очеревинних порожнинах спостерігалося накопичення асцитичних рідин. Для її відбору використовували трубку спеціальної голки довжиною 4см. Голки стерилізували шляхом обробки етиловим спиртом. Черевину миші обробляли етиловим спиртом та робили голкою прокол справа або зліва від серединної лінії на 1см нижче від реберної дуги, відбирали асцитичну рідину у полімерну пробірку на 15мл. Після відбору рідини місце проколу обробляли спиртовим розчином йоду та на 1хв. затискали пінцетом. Повторний підбір асцитичної рідини проводили через 2-3 дні. Процедуру підбору асциту проводили доти, доки тварина залишалася живою. У середньому одна миша здатна дати 5мл асциту за один відбір. Асцитичну рідину центрифугували у пробірці на 15мл при 5000об/хв. упродовж 5хв. Відбирали освітлену фракцію та зберігали у флаконах при мінус 20°С. Приклад 2 Виділення та очистка МКАТ 131А9, 136D5. Розморожували асцитичну рідину та переносили її у центрифужну пробірку та освітлювали при 4000об/хв. протягом 30хв. Після цього асцитичну рідину фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм (Sigma, США, кат. номер F8273). Для афінної очистки використовували колонку з білком А-сефарозою об'ємом 10мл. Перед нанесенням асцитичної рідини колонку промивали із швидкістю 1,5-2мл/хв 5-10 об'ємами 0,02М натрійкалій фосфатного буферу, рН 7,0-7,2 (КН2РО4 та Na2HPO4). Фільтровану асцитичну рідину в об'ємі 47440 4 20мл пропускали через колонку зі швидкістю 1мл/хв. Після цього промивали колонку 10-15 об'ємами фосфатного буферу. Елюцію проводили за допомогою ОДМ лимонної кислоти в об'ємі 15мл. Вихід МКАТ 131А9, 136D5 реєстрували при 280нм. Пік, який виходить із колонки збирали у флакон, що містив 2мл 1М трис основи. рН одержаного розчину мав становити 7,0-8,0, що контролювали за допомогою індикаторного паперу. Значення рН коректували додаванням кислоти або трис-основи. Після виходу піка колонку промивали із швидкістю 1,5-2мл/хв 10-20 об'ємами 0,02М натрій-калій фосфатного буферу до нейтрального рН. МКАТ 131А9, 136D5 концентрували за допомогою насиченого розчину сульфату амонію. Для цього до охолодженого препарату МКАТ додавали насичений розчин сульфату амонію до 40-50% насичення. Витримували при 4°С упродовж 2-3 години, після чого центрифугували 20хв при 4000об/хв. при кімнатній температурі. Осад МКАТ ресуспендували в розчині сульфату амонію 40%-ого насичення та переносили у центрифужні пробірки на 15мл. Центрифугували у кутовому роторі при 10000об/хв. протягом 20хв. Надосад старанно видаляли, а осад МКАТ розчиняли в мінімальній кількості (1-2мл) деіонізованої води. Розчин переносили у мікропробірки та освітлювали при 10000об/хв. протягом 10хв. Освітлені МКАТ 131А9, 136D5 переносили до спільного флакону. Концентрація MKAT 131A9, 136D5, одержаних таким способом, коливається від 15 до 50мг/мл. Одержаний розчин МКАТ фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм. Стандартний фосфатний буфер (рН 7,2-7,4) фільтрували через фільтри з порами 0,45мкм. Використовували колонку 1,5×20см з сефадексом G25 (Amersham Pharmacia Biotech, 17-0033-01) зрівноважену фосфатним буфером шляхом пропускання його із швидкістю 2мл/хв. протягом 20хв. МКАТ в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після поглинання розчину гелем наносили такий же об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу колонку заповнювали фосфатним буфером доверху, вставляли адаптер та проводили елюції фосфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Вихід піку реєстрували при 280нм. Збирали фракцію МКАТ в окремий флакон, додавали 1% 10%-ого азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 4 місяців. Приклад 3 Виділення та очистка МКАТ 133G12. Розморожували асцитичну рідину із вмістом моноклональних антитіл 133G12 та переносили її у центрифужну пробірку на 15мл. Пробірку поміщали у нагріту до 37°С воду на 10 хвилин. Зважували сульфат натрію в кількості, потрібній для 18%-го насичення (вага на об'єм) асцитичної рідини, всипали у пробірку з асцитом та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням в осад МКАТ. Пробірку центрифугували при 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили у 5мл деіонізованої води. Пробірку поміщали у нагріту до 45-50°С воду на 5 хвилин. Знову 5 47440 зважували сульфат натрію у кількості, потрібній для 16%-го насичення (вага на об'єм) розчину антитіл, всипали у пробірку та старанно струшували до розчинення сульфату натрію. Спостерігали помутніння, зумовлене випадінням антитіл в осад. Пробірку центрифугували при 10000об./хв впродовж 5 хвилин у кутовому роторі. Після чого надосад видаляли, а осад антитіл розводили у 2-3мл деіонізованої води. Одержаний розчин МКАТ фільтрували через фільтри з порами 0,22мкм. Для переведення МКАТ у фосфатний буфер використовували 0,02М фосфатний буфер (рН 7,2-7,4) та колонку 1,5×20см з сефадексом G25 зрівноважену фосфатним буфером. МКАТ, одержані раніше, в об'ємі 2-3мл наносили на гель, після поглинання розчину гелем наносили такий же об'єм буферу. Після поглинання гелем буферу колонку заповнювали фосфатним буфером доверху, вставляли адаптер та проводять елюцію фосфатним буфером із швидкістю 2мл/хв. Вихід піку реєстрували при 280нм. Збирали фракцію МКАТ в окремий флакон, додавали 1% 10%-ого азиду натрію та зберігали при плюс 4°С до 6 місяців. Приклад 4 Спосіб одержання кон'югат МКАТ з пероксидазою хрону. Кон'югацію МКАТ з ферментом пероксидазою хрону здійснювали у співвідношенні антитіл до ферменту 2:1 (масові долі) методом періодатного окислення за P. Tijssen (Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays // Lab. Techiques in Biochem. and Molecular Biology. - 1985. - 15. 674p.) із власними модифікаціями. При окисленні пероксидазу хрону розчиняли у 0,1М бікарбонатному буфері, рН 8,3, до концентрації 15мг/мл та додавали такий же об'єм 14мМ водного розчину періодату натрію. Суміш інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Одержаний таким чином розчин активованої пероксидази додавали до розчину антитіл, які попередньо діалізували проти 0,1М карбонатного розчину, рН 9,2. Суміш переносили у герметичну хроматографічну колонку та додавали 1/3 частину Комп’ютерна верстка А. Рябко 6 сухого сефадексу G25, інкубували протягом 3 годин при кімнатній температурі. По закінченні інкубації, розчин кон'югату елюювали з колонки та зупиняли реакцію додаванням 1/20 об'ємні частини водного розчину NaBH4 (5мг/мл), залишаючи на 30хв. при кімнатній температурі. Після цього ще додавали 3/20 частини розчину боргідриду натрію, інкубували протягом 60хв. Одержаний розчин пероксидазного кон'югату МКАТ переводили у 0,02М фосфатний буфер з 0,15М NaCl шляхом діалізу. Приклад 5 Використання кон'югатів МКАТ з пероксидазою хрону у складі імуноферментних тест-систем. У лунки 96-лункового полістеролового планшету, що сенсибілізовані рекомбінантними антигенами Chlamydia trachomatis або Helicobacter pylori, або Mycoplasma hominis, або Mycoplasma pneumoniae, або Ureaplasma urealyticum вносили по 40мкл досліджувані сироватки крові людини, позитивний та негативний контролі й по 80мкл розчин для їх розведення. Планшет інкубували при 37°С упродовж 1 години та відмивали фосфатно-сольовим буфером з детергентом (ФСБД) 4 рази. Розчин кон'югату моноклональних антитіл вносили по 100мкл в лунку, інкубували при 37°С протягом 30 хвилин та відмивали ФСБД 6 разів. Далі в лунки вносили по 100мкл розчину хромогену (3,3',5,5'-тетраметилбензидину) та інкубували при 18-25°С в темному місті протягом 30 хвилин, після чого реакцію зупиняли внесенням у всі лунки по 100мкл 0,5М сірчаної кислоти. Через 5 хвилин після зупинення реакції визначали оптичну густину при 450нм/620нм. Розраховували рівень граничного значення (ГЗ) додаючи до середнього значення оптичної густини негативного контролю величину 0,2. Для кожного досліджуваного зразка сироватки крові людини розрахувати індекс позитивності (ІП) шляхом ділення значення оптичної густини відповідного зразка на ГЗ. Досліджувані зразки із значенням ІП рівним та вище 1,0 вважати позитивними на відповідний серологічний маркер, а зразки із значенням ІП нижче 1,0 вважати негативними. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601